问答题
举出4种常用的分子生物学基本实验技术,并说明其作用?
分子生物学实验技术有很多,这里列出五种供参考。
【正确答案】(1)凝胶电泳,以DNA样品检测或鉴定为例,最常用的方法就是通过凝胶电泳观察条带。利用琼脂糖或聚丙烯酰胺配制成一定浓度的凝胶,将DNA样品分孔道点入后,在电流作用下DNA由负极向正极移动。不同大小的DNA移动速度不同,用溴化乙锭(EB)染色之后放置在紫外光下观察,与标准样品(marker)比较后便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位。此法可用于PCR产物和酶切产物等DNA样品的鉴定,也可用于DNA纯化。
(2)Northern blotting杂交技术,这是较为传统的实验方法。用DNA探针检测特异序列的RNA。首先从待研究组织或细胞中提取全RNA,在变性琼脂糖凝胶电泳中分离,再把RNA条带转移到纤维膜上,进行一定处理后用32P探针与膜杂交,放射自显影检测特定RNA条带。此方法主要检测特异mRNA分子大小及表达量,以分析细胞生长发育过程中特定基因的作用。
(3)PCR,全称为polymerase chain reaction,即聚合酶链式反应。这是现代分子生物学中基因扩增最常用技术之一。利用两种寡核苷酸引物分别与特异性DNA区段的正链和负链末端互补,经过模板DNA变性,模板DNA—引物的配对,在DNA聚合酶作用下发生引物延伸反应,3个反应阶段后生成新的子代DNA双链。多次循环后可得到大量目标DNA片段。
PCR技术具有操作简便、省时、灵敏度高对原始材料的质和量要求低的特点,使得PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于各个领域,如基因克隆、疾病诊断、新子鉴定等。
(4)酵母双杂交体系。利用真核生物转录调控因子的组件式结构特征,将DNA结合结构域(BD)与转录激活结构域(AD)分开融合到两个不同的蛋白上,当两个蛋白发生相互作用,BD和AD起作用,激活下游报告基因转录。该技术可用于筛选与靶蛋白相互作用的未知蛋白。
(5)染色体步移法。与目标克隆基因连锁近遗传标志出发,以其为探针在基因组文库中筛选片段,阳性克隆末端的限制性片段进而被用做探针从基因组中筛选重叠区域。反复操作后即可实现在染色体上“步移”到目标基因的准确位点。这项技术称为染色体步移技术。染色体步移技术可以实现从已知最近位点(EST或其他连锁基因)克隆基因,获取新物种中基因的非保守区域从而获得完整的基因序列,或鉴定插入位点。
【答案解析】