问答题
(浙江大学2007年考研试题)什么是蛋白质?分类并举例描述蛋白质的功能;描述你最熟悉的5种蛋白质分离纯化的工作原理。
【正确答案】正确答案:(1)蛋白质由一条或多条多肽链组成的生物大分子,每一条多肽链有二十至数百个氨基酸残基不等,各种氨基酸残基按一定的顺序排列;蛋白质厂‘泛存在于各种生物组织细胞,是生物细胞最重要的组成物质。 (2)蛋白质的分类。 (a)按分子形状分类:①球状蛋白,外形近似球体,多溶于水,大都具有活性,如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于10;②纤维状蛋白,外形细长,分子量大,大都是结构蛋白,如胶原蛋白,弹性蛋白,角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等,后者如胶原蛋白,弹性蛋白,角蛋白等结构蛋白。 (b)按分子组成分类:①简单蛋白,完全由氨基酸组成,不含非蛋白成分,如血清蛋白等。根据溶解性的不同,可将简单蛋白分为以下7类:清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和硬蛋白;②结合蛋白,由蛋白质和非蛋白成分组成,后者称为辅基。根据辅基的不同,可将结合蛋白分为以下7类:核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血红素蛋白、黄素蛋白和金属蛋白。 (c)根据溶解度分类:①可溶性蛋白,指可溶于水,稀中性盐和稀酸溶液,如清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋白等;②醇溶蛋白,不溶于水、稀盐,而溶于70%~80%的乙醇溶液,如醇溶谷蛋白;③不溶性蛋白,不溶于水、中性盐、稀酸、碱和一般有机溶剂,如角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等。 (d)根据功能分类:①活性蛋白质,具有一定的生物活性,大多为球状蛋白质;②非活性蛋白质,主要包括一大类起保护和支持作用的蛋白质,实际上相当于按分子形状分类的纤维状蛋白和按溶解度分的不溶性蛋白。 (e)根据营养价值不同:①完全蛋白,含有人体所必需的八种氨基酸;②不完全蛋白,缺乏人体所必需的某种氨基酸。 (3)利用蛋白质各种性质的不同来对蛋白质进行分离纯化,如溶解度(盐析)、大小(凝胶过滤法)、电荷(离子交换层析)及结合特异性(亲和层析)等性质。也可根据蛋白质不同的分子量(SDS—PAGE电泳)和等电点(等电聚焦电泳),用电泳的方法分离纯化蛋白。将两种电泳结合即双向电泳。 (a)盐析:当溶液的离子强度增加到一定数值时,蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和的程度,很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析。 盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水基团接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可利用的水分,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。随着盐浓度的增加,蛋白质疏水表面进一‘步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。因此最先聚集的蛋白质是表面上疏水残基最多的蛋白质。 (b)SDS—PAGE电泳:SDS为强变性剂,能破坏蛋白质中H键,具疏水作用,巯基乙醇能打开二硫键,SDS与蛋白质分子结合,使其带上大量相同密度的负电荷,掩盖了蛋白质原有的电荷差异,且使蛋白质分子呈棒状,长度与分子量成正比。 电泳时由于凝胶的分子筛效应,分子量小的蛋白质迁移速度快,分子量大的慢。 (c)离子交换柱层析:层析即色层分析也称色谱,通常由两部分组成,一个为固定相或静相,一个为流动相或动相。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况,一般用分配系数来描述。 离子交换柱层析是一种用离子交换树脂作支持剂的层析法。蛋白质对离子交换剂的结合力取决于它们之间相反电荷的静电吸引,而这又和溶液的pH有关,因为pH决定离子交换剂和蛋白质的电离程度。因此,蛋白质混合物的分离可由改变溶液中的pH和盐浓度(离子强度)来完成,对离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱中洗脱出来。 (d)凝胶过滤法的基本:不同大小的分子混合物流进凝胶层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而随溶剂首先流出柱外;比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶珠内外,流出速度慢。这样,由于不同大小分子所经路径不同而得到分离。越小的出来越晚。 (e)亲和层析:是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力),建立起来的一种有效的纯化方法。它经常只需要一步的处理就可将某种需要的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。 亲和层析基本原理是把待纯化的某一蛋白质的特异配体,通过适当的化学反应共价连接到像琼脂糖胶一类的载体表面授功能基上。一般在配体和多糖载体之间插入一段长度适当的连接臂或称间隔臂,使配体与凝胶之间保持足够的距离,不致因载体表面阻碍待分离的分子与配体的结合。这类载体在其他性能方面允许蛋白质能自由通过。当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时,待纯化的某一蛋白质能自由通过。 当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时,待纯化的某一蛋白质则被吸附在含配体的琼脂糖颗粒表面上,而其他的蛋白质(杂蛋白)则因对该配体无特异的结合部位而不被吸附,它们通过洗涤即可除去,被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把它从柱上洗脱下来。
【答案解析】