20. 已知FADD由两个相对独立的结构域DED和DD组成,为验证FADD与Fas的相互作用,并寻找FADD中与Fas相互作用的主要结构域,分别构建带有Flag标签的FADD表达质粒(Flag-FADD)、DED表达质粒(Flag-FADD-DED)、DD表达质粒(Flag-FADD-DD),与带有HA标签的Fas表达质粒,共转染293细胞,使其过量表达,利用抗Flag抗体进行免疫共沉淀实验,抗HA抗体进行Western blotting分析,结果如图所示:
【正确答案】图b中泳道1~4分别为细胞裂解液中诱饵蛋白的表达量,其中1~3泳道反映诱饵蛋白Flag-FADD、Flag-FADD-DED、Flag-FADD-DD表达量相当,泳道4因为Fllag的相对分子质量较小,不在检测范围内,所以未见条带。
泳道5~8分别为各组co-IP实验的上清液,可见泳道5~7中各诱饵蛋白的含量均显著下降,因为抗Flag的抗体将各组诱饵蛋白“沉淀”(与磁珠结合)了,同泳道4的原因,泳道8未见检测条带。
泳道9~12分别为各组co-IP实验的“沉淀”(与磁珠结合)部分,可见泳道9~11中均有各诱饵蛋白,同理泳道12未见检测条带。
图a中泳道1~4分别为细胞裂解液中目标结合蛋白的表达量,可见各组实验中HA-Fas的表达量相当。
泳道5~8分别为各组co-IP实验的上清液,可见泳道5和7中HA-Fas的含量显著下降,说明它们分别通过与诱饵蛋白Flag-FADD和Flag-FADD-DD的相互作用而被“沉淀”(与磁珠结合)了,相比之下泳道6和8中HA-Fas的含量并未减少,说明它们未与诱饵蛋白Flag-FADD-DED和对照组中的Flag结合。
泳道9~12分别为各组co-IP实验的“沉淀”(与磁珠结合)部分,可见泳道9和11中均有目标蛋白HA-Fas,说明诱饵蛋白F1ag-FADD和Flag-FADD-DD可以与HA-Fas相互作用而发生共沉淀,泳道10、12中则未检测到目标蛋白HA-Fas,说明诱饵蛋白Flag-FADD-DED和对照组中的Flag不能与HA-Fas相互作用。
综上所述,FADD通过DD结构域与Fas相互作用。
【答案解析】