【正确答案】(1)TAIL-PCR的主要技术 热不对称交错多聚酶链式反应(TAIL-PCR)常用于扩增T-DNA插入位点侧翼序列，从而获得转基因植物插入位点特异性分子证据。TAIL-PCR使用一套巢式特异引物(T-DNA边界引物，TR)和一个短的随机简并引物(AD)，分为3轮反应。 ④第一轮PCR反应(PCR Ⅰ) PCR Ⅰ是TAIL-PCR的重要环节。 a.以TR1和AD为引物，进行5个高严谨性循环，特异性引物TR1与模板退火，只能发生单引物循环，T-DNA上游侧翼序列得到线性扩增。 b.大幅度降低退火温度，使AD及TR1均与模板DNA结合，指数扩增一个循环。 c.两个高严谨、一个低严谨循环交替进行，共15个循环。 特异性序列(两端分别拥有TR1和AD序列)和非特异性序列Ⅰ(只有TR1，没有AD序列)远超过非特异性序列Ⅱ(两端均为AD序列)。 ②第二轮PCR反应(PCRⅡ) 将第一次反应的产物稀释1000倍作为模板，以TR2和AD为引物，进行12个TAIL-PCR循环，特异性序列被优先扩增，非特异性序列Ⅰ大大降低。 ③第三轮PCR反应(PCRⅢ) 将第二次反应的产物稀释1000倍作为模板，以TR3和AD为引物，通过20次普通的PCR循环扩增特异性序列，即得到较高含量的与已知序列邻近的目标序列。 (2)TAIL-PCR的原理 以基因组DNA为模板，通过依照目标序列旁的已知序列设计3个较高退火温度的嵌套特异性引物(SP)和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(AD)相组合，利用3轮具热不对称的温度循环的分级反应，即不同的退火温度，来进行选择性地PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。