结构推理
TPCK是胰凝乳蛋白酶的亲和标记试剂,它对His57烷基化后使胰凝乳蛋白酶失活。(1)为胰蛋白酶设计一个像TPCK那样的亲和标记试剂。(2)你认为怎样可以检验它的专一性?(3)能被胰蛋白酶的这个亲和标记试剂失去活性的还有哪个丝氨酸蛋白酶?
【正确答案】首先分析TPCK作为胰凝乳蛋白酶的亲和标记试剂的特征结构,亲和标记试剂有两个特点:①亲和标记试剂与底物非常类似,但缺乏可以被酶作用的位点,因而能选择性地与酶的活性部位结合,但不被酶作用,TPCK的结构中这一部分是对甲苯磺酰~苯丙氨甲基酮;②亲和标记试剂有活泼的化学基团,可以与靶酶的活性部位中的某个残基反应,形成稳定的共价键。TPCK的反应基团是-CH3-Cl。其次分析胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的相似之处。已知胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶均催化肽键的裂解反应,其结构和作用机制很相似,它们的活性部位都位于酶分子表面凹陷的口袋中,都有由His、Asp和Ser形成的催化三联体,只是专一性明显不同。胰凝乳蛋白酶的口袋被疏水氨基酸环绕,大到足以容纳一个芳香残基,因此该酶选择裂解芳香氨基酸如Phe和Tyr的羧基侧肽键。而胰蛋白酶口袋的底部有一个带负电荷的Asp189有利于结合带正电荷Arg和Lys残基。根据上述分析可知:(1)为胰蛋白酶设计一个类似TPCK的亲和标记试剂,可以将TPCK的反应基团-CH2-Cl和类似肽键结构-NH-CH-CO-保留,其余部分更换为带正电荷的Arg或Lys的R基团或其类似物;(2)检验该抑制剂的专一性实际上就是分析其与酶的竞争结合能力,可以设计动力学实验,即分析在没有抑制剂时和有不同浓度抑制剂存在时反应速度随底物浓度的变化;(3)由于弹性蛋白与上述两种酶空间结构和催化机理相似,推测该亲和标记试剂有可能使弹性蛋白酶失活。
【答案解析】