革兰氏染色步骤：初染、媒染、脱色和复染。具体步骤如下：在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，固定。用草酸胺结晶紫染色1min，水洗去掉浮色。用碘－碘化钾溶液媒染1min,倾去多余溶液。用中性脱色剂如乙醇或丙酮酸脱色，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。用番红染液复染1min，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色，这样细菌被区分开。

革兰氏染色的机制：革兰氏阴性菌的脂类物质的含量很高，肽聚糖的含量低，脂类物质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径及其通透性，乙醇很易进入细胞内将草酸胺结晶紫、碘－碘化钾复合物提取出来，使菌体呈现无色。革兰氏阳性菌由于脂类物质含量很低，而肽聚糖含量高，乙醇既是脱色剂又是脱水剂，使肽聚糖脱水缩小细胞壁的孔径，降低细胞壁的通透性，阻止乙醇分子进入细胞，草酸胺结晶紫和碘－碘化钾的复合物被截留在细胞内而不被脱色，仍呈现紫色。

乙醇脱色是染色成功与否的关键，乙醇脱色时间过短，可能导致革兰氏阴性菌脱色不够，表征为紫色，染色结果出错，若脱色时间过长，可能导致革兰氏阳性菌结晶紫脱除，表征为红色，染色结果也出错。

番红染色是可以省略的步骤，革兰氏阳性菌的表征仍为紫色，而革兰氏阴性菌的表征则为无色，由此可以区分两种细菌。