所有线粒体基质蛋白N端靶向信号序列虽然不尽相同，但共享相同的基序，这样的氨基酸残基组成有利于基质蛋白的靶向信号序列形成两性的α螺旋构象。因此，蛋白质在细胞质中合成之后，可以分选到线粒体基质。具体步骤如下：

（1）蛋白质以1种途径从细胞质基质输入到线粒体基质。

①前体蛋白在游离核糖体合成释放之后，在细胞质分子伴侣Hsc70的帮助下保持未折叠或部分折叠状态；然后通过N端的转运肽与内外膜接触点附近的输入受体(Tom20/22)结合。

②前体蛋白在受体的内外膜接触点处利用ATP水解产生的能量驱动前体蛋白进入转运蛋白的运输通道。

③在基质蛋白酶作用下，输入的基质蛋白的转运肽被切除，同时Hsc70从新输入的基质蛋白上释放出来，正确折叠产生活性构象。

（2）蛋白质以3种途径从细胞质基质输入到线粒体内膜。

①途径1和途径2

前体蛋白在N端的基质导向序列引导下采用与线粒体基质蛋白同样的运输方式，将前体蛋白转运到线粒体基质，基质靶向序列被切割后再被装配到内膜。

二者区别是通过途径2输入的内膜蛋白还具有可被内膜蛋白Oxa1所识别的内在疏水结构域。

②途径3：输入的内膜蛋白是多次跨膜蛋白，缺少N端基质靶向序列，但含有被Tom70/Tom22输入受体识别的多个内在靶向序列。其中两种膜间隙蛋白（Tim9/10）起协助输入蛋白在内外膜通道之间转运的分子伴侣作用。

（3）蛋白质以2种途径从细胞质基质输入到线粒体膜间隙。

①途径1（主要途径）：与内膜蛋白途径1类似，主要不同点是蛋白质内在靶向序列预定其定位在膜间隙，且在转运过程中被内膜上蛋白酶于膜间隙一侧切割，蛋白质被释放到膜间隙与血红素结合。

②途径2：转运的蛋白通过外膜Tom40输入孔，直接进入膜间隙。