结构推理 何谓抗生素抗性基因插入失活法?何谓β-半乳糖苷酶显色反应法?在筛选阳性克隆时,后者为何比前者更为简单有效?
【正确答案】抗生素抗性基因插入失活法是指将外源DNA插入到载体中任何一个抗生素抗性基因编码序列内,导致抗生素抗性基因“插入失活”。如在质粒中含有四环素抗性基因,四环素抗性基因内含BamHⅠ位点,若将外源DNA插入此位点,然后转化大肠杆菌(tets)并培养在含四环素的平板上。那些含有外源DNA的转化细胞失去对四环素的抗性,所以不能在四环素平板上生长。而不含外源DNA的转化细胞,则可在四环素的平板上生长。这样通过四环素平板和非四环素平板得影印平板对照,就可以在非四环素平板上筛选到含有目的基因的细菌。
   β-半乳糖苷酶显色反应法:许多载体中含有β-半乳糖苷酶(lacZ)的调控序列和该酶N端氨基酸(α肽)的编码序列,并在这个编码区中插入一个多克隆位点,但没有破坏其可读框,也不影响其正常功能。大肠杆菌lacZΔM15突变株含有缺失N端编码序列的β-半乳糖苷酶基因(编码ω片段)。N端缺失的该酶单体不能形成有活性的四聚体,α肽可补足缺陷而恢复酶活性,称为α-互补。在含有IPTG和X-gal的培养基中,IPTG诱导产生有活性的β-半乳糖苷酶使培养基中的生色底物X-gal分解,产生半乳糖和深蓝色底物,故形成蓝色菌落。当外源DNA插入载体的多克隆位点中,破坏了α肽的可读框,α肽失活,失去互补能力,在同样的培养基上形成白色菌落,从而将二者区别开来。
   β-半乳糖苷酶显色反应法可以将重组菌和非重组菌在同一平板上区别开来,而抗生素抗性基因插入失活法必须对照含有抗生素和不含抗生素的影印实验中在非抗生素平板上才可以得到,易被其他非抗性菌株污染和干扰。
【答案解析】