（1）实验原理

为了研究特异性mRNA在细胞中的水平情况，先对细胞中总RNA进行提取，然后通过Northern印记分析确定mRNA水平情况。

（2）实验步骤

①细胞传代、冻存及复苏

a．传代培养：将细胞在37℃水汽饱和并含有5%CO₂培养箱培养，细胞每隔3～4天传代培养一次。

b．冻存：细胞培养3～4天后，3000g离心5min，弃上清液，加入适量的新鲜培养基，用滴管反复吹打，将细胞液移至冻存管中，再加入DMSO使终浓度为10%。置于-70℃过夜，次日放入液氮中保存。

c．复苏：从液氮中取出冻存细胞，置于37～42℃水浴中并剧烈震荡使细胞快速融化，将细胞悬液移入8～10ml培养基培养一天后换新鲜培养基，以后按常规进行细胞传代。

②细胞总RNA抽提

a．每10⁶个细胞加0.2mlRNATrizol变性液，用吸管反复吹吸使溶液均匀，RNA溶解。

b．每1ml样品中加0.2ml氯仿，用力振摇15s，置冰浴15min。

c．4℃、12000g离心10min，用75%乙醇洗两次，室温自然干燥，最后溶于DEPC水中。

③制备探针

④Northern印记分析

a．每个样品取25～30μgRNA进行电泳。

b．电泳完毕，凝胶经EB染色后紫外灯下观察电泳结果。

c．将胶块倒置于水平玻板上，胶下有纸桥与20XSSC相连，胶上依次覆盖尼龙膜、Whatmann3MM滤纸、普通新华滤纸或吸水纸及500g重物。室温下转移24～48h。

d．转移完毕，检查尼龙膜及胶上EB染料分布情况，判断转移效率，用滤纸吸去多余水分，室温晾干，80℃烘烤2h。

⑤杂交、洗膜及放射自显影

⑥统计分析

以细胞种类和辐照时间为协变量，对mRNA水平情况进行协方差分析。