问答题 如何证明Ser 195 和His 57 参与了胰凝乳蛋白酶活性,试分析胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的底物专一性,并说明原因。
【正确答案】
【答案解析】酶活性中心的鉴定方法:
(1)化学修饰法。观察酶分子被一定的化学试剂修饰前后酶活性的变化情况,结合其他方法,推断该基团是否为活性中心的功能基团。如胰凝蛋白酶与二异丙基氟磷酸(DIFP)作用即会失去活性。DIFP能与酶分子中的Ser残基共价结合,胰凝乳蛋白酶中有28个ser残基,而与DIFP作用的仅仅是其中的Ser 195 。这表明Ser 195 是胰凝乳蛋白酶活性中心的组成部分。
(2)亲和标记法。是使用一个能与酶的活性中心特异结合的正常底物类似物作为活性部位基团的标记试剂。该类似物不能为酶所催化而发生化学反应,却能与酶的特定基团发生共价结合使酶失活。例如,N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)是胰凝乳蛋白酶的亲和标记物,当用C 14 标记的TPCK与胰凝乳蛋白酶一起保温时,酶即失活。结构分析证明TPCK与酶分子中的His 57 发生作用。说明His 57 是活性中心的另一组成部分。
(3)X射线衍射分析法。可直接观察酶与底物的结合情况。