结构推理 试述Southern印迹杂交的基本步骤。
【正确答案】(1)待测核酸样品的制备:抽取纯化基因组DNA,用DNA限制性内切酶将其切割成大小不同的DNA片段,可用一种限制酶消化,也可用两种限制酶进行消化。(2)待测DNA样品的电泳分离:将待测DNA样品加入到琼脂糖的凝胶孔中,在适当的缓冲液中,DNA带负电荷,在电场中即向正极移动。琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质,具有分子筛作用。分子越大,泳动速度越慢;分子越小,泳动速度越快。大小相同的分子泳动速度相同,经电泳后,处于同一条带;大小不同的分子经电泳后就形成许多带。(3)凝胶中核酸的变性(碱变性):转膜前对凝胶中的DNA片段进行碱变性及中和处理。(4)Southern印迹:Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。Southern印迹的常用方法有毛细管虹吸印迹法、电转移法、真空转移法。通常将DNA分子转移至硝酸纤维素(NC)膜上,与溶液中的探针进行杂交反应。(5)制备探针:探针可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段。(6)Southern杂交:包括预杂交和杂交。预杂交的目的是将膜上所有能与DNA结合的位点封闭,预杂交液是不含有DNA探针的杂交液。预杂交后加入DNA探针与膜上的待测DNA进行杂交反应。(7)杂交结果的检测:如果所用探针是用放射性核素标记的,则通过放射自显影检测;是用生物素或地高辛标记的,则通过比色或化学发光法检测。
【答案解析】