【正确答案】计算各组分用量如下:
Tris用量:10×0.15mol/L×0.400L×121g/mol=72.6g;
NaCl用量:10×200/1000mol/L×0.400L×58.5g/mol=46.8g。
配制过程:分别称取Tris 72.6g,NaCl 46.8g,置于烧杯中,加入400ml超纯水或蒸馏水溶解,用盐酸调节pH值至8.0,混匀即可。
(2)计算各组分用量如下:
琼脂糖用量:200ml×1%g/ml=2g;
溴化乙锭用量:200ml×1μg/ml÷10μg/ml=20μl;
所需TBE量:200ml×0.5÷5=20ml。
配制过程:称取2g琼脂糖放入锥形瓶中,加入180ml超纯水或蒸馏水,加入5×TBE母液20ml,用微波炉加热至沸腾3次以上(或121℃湿热灭菌15min),待溶液冷却至50~60℃,加入10mg/ml的EtBr 20μl,轻轻震荡混匀,倒入模具中即可。
(3)计算DNA用量:200μl×25÷400=12.5μl
配置过程:用移液器吸取400μg/ml的商用DNA标样12.5μl,加入187.5μl无菌超纯水(可事先灭菌),吹打均匀即可。
(4)进行酶切反应的配方如表附录5-1所示。
表附录 5-1
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| EcoR Ⅰ | 0.2μL | BamH Ⅰ | 0.2μL |
| 10×buffer | 1.5μL | 10×BSA | 1.5μL |
| DNA | 8μL(200ng) | ddH2O | 3.6μL |
操作过程:将酶切体系至于37℃恒温条件反应1h后65℃加热10min,使酶变性失活终止反应。