简述酵母单、双杂交系统的基本原理与应用。
 
【正确答案】(1)酵母单杂交系统。 ①基本原理:将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter,Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游。将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(transcription—activating domain,AD)融合表达载体导入酵母细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。 ②应用:主要用于确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用;用于分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;用于定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 (2)酵母双杂交系统。 ①基本原理:运用基因重组技术把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子(常为GAL1、GAL4或GCN1)DNA结合结构域编码区(BD)的表达载体上;导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白,与报告基因上游的启动调控区相结合,准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物,若将已知的编码转录激活结构域(AD)的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接,获得“猎物”载体,转化含有“诱饵”的酵母细胞,一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用,不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢,激活报告基因表达;分离有报告基因活性的酵母细胞,得到所需要的“猎物”载体,就能得到与已知蛋白相互作用的新基因。 ②应用:主要应用于研究蛋白质之间的相互作用。利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能;在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用;筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响;利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图。
【答案解析】