【正确答案】差别杂交:细胞在不同的发育、分化和生理状态下其基因表达往往有差别,有些决定某种状态的特异基因只在该状态的细胞中表达,利用差别杂交法可以分离出该特异的基因克隆。适用于分离经特殊处理而被诱发表达的mRNA的cDNA克隆。例如,为了了解生长因子对激活细胞基因表达的调节作用,将细胞培养物生长因子调节基因的克隆,是差别杂交成功应用的一个典型例子。我们知道,血清中含有生长因子,因此用血清处理处于静止期的细胞时,便会迅速诱发生长因子调节基因进行表达。所以,分别从静止期细胞培养物和经血清激活3h的细胞培养物中提取的poly(A)m]RNA制剂,在mRNA种类上是有差别的,至少后者比前者多出了一种生长因子调节基因的mRNA。用从激活细胞中分离的poly(A)mRNA反转录合成的cDNA与λ噬菌体载体重组,构成cDNA文库,并同时复制两份硝酸纤维素滤膜。A组滤膜同血清激活细胞制备的cDNA探针杂交,B组滤膜同静止期细胞制备的cDNA探针杂交。将所得的放射自显影图片进行仔细的比较,从中鉴定出只同激活细胞探针杂交而不能同静止期细胞探针杂交的噬菌斑位置。这些克隆便有可能是带有受血清诱发表达的生长因子调节基因的DNA编码序列。
扣除杂交:用一般细胞的mRNA与特殊细胞的cDNA杂交,先扣除一般共有的cDNA,再将剩下特异的cDNA进行克隆。例如:扣除杂交法可以用来分离缺失突变基因。从野生型植株制备的染色体总DNA,用一种适当的核酸内切限制酶(比如Sau3A)切割成小片段。同时从缺失突变体植株制备的染色体总DNA,经随机切割之后,用生物素(biotin)进行标记,供作非同位素标记探针使用。取大量的此种探针,同Sau3A酶切的野生型染色体总DNA片段混合,经变性、退火处理,溶液中的无生物素标记的野生型的DNA分子便同生物素标记的突变型的DNA探针杂交。将杂交反应混合物通过生物素结合蛋白质柱(avidin column)。这种柱是用包裹着生物素结合蛋白质的专用的细小磁珠装填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突变型植株的生物素标记的DNA探针杂交,便被结合到柱上。而野生型植株的DNA片段,由于在突变型DNA中缺失了相应的片段,故没有相应的生物素标记的探针与之杂交,经洗脱便通过柱流出。随后将洗脱收集的DNA同超量的生物素标记探针再杂交,再过柱。如此经过多次重复富集之后,用PCR法扩增DNA片段,并予以克隆。最后用Southern杂交法进一步鉴定出,只同野生型DNA杂交而不能同突变型DNA杂交的含有突变基因的阳性克隆。
【答案解析】