问答题 说出免疫共沉淀(CoIP)实验的原理与过程,比较酵母双杂交技术和免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优缺点。
【正确答案】
【答案解析】(1)免疫共沉淀(CoIP)实验的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白。首先,将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上,再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中,用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。如果靶蛋白质与待筛选蛋白发生了相互作用,那么,这个待筛选蛋白质就通过靶蛋白与抗体和固体基质相互作用而被分离出来。
免疫共沉淀技术在研究蛋白质相互作用方面的优点:相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点:可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
(2)酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤;检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况;检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用;酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。酵母双杂交系统局限性和存在的问题:双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行;有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究;酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。