问答题 蛋白质分离纯化技术中哪些与它的等电点有关?试述这些技术分离纯化的原理。
【正确答案】
【答案解析】蛋白质分离纯化技术中主要有等电点选择性沉淀和等电聚焦电泳两项技术与蛋白质的等电点有关。
等电点选择性沉淀:蛋白质分子属于两性离子,所带电荷因溶液pH不同而变化,当所带正负电荷相等时,溶液的pH即为该两性离子的等电点。在等电点时,蛋白质分子以双极离子存在,总净电荷为零,颗粒无电荷间的排斥作用,易凝集成大颗粒,因而最不稳定,溶解度最小,易沉淀析出。不同等电点的蛋白质可以通过调整溶液pH依次沉淀,并且沉淀出来的蛋白质可保持天然构象,能再溶解于水中并具有生物活性。
等电聚焦电泳:蛋白质在等电点时,总净电荷为零,在外电场作用下,既不向正极移动,也不向负极移动。各种蛋白的等电点不同,在同一pH时所带电荷不同,在同一电场作用下移动的方向和速度也不同,可用电泳来分离提纯蛋白质。等电聚焦电泳利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子质量的有机酸和碱的混合物,该混合物称之为两性电解质(ampholytes)。当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时,每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处,具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处,达到分离的目的。