问答题
(东北师范大学2008年考研试题)用分光光度法测定生物分子含量的原理是什么?为何有些物质需要用可见分光光度计,而有些要用紫外分光光度计?写出用分光光度法测定淀粉酶中蛋白质含量的方法步骤。
【正确答案】正确答案:(1)分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术,其基本原理是Lambert-Beer定律(光吸收定律),即一定温度下,一定波长的单色光通过均匀的、非散射的溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。所以町通过测量溶液的吸光度来求得被测组分的含量。 (2)可见分光光度计的应用波长范围为400~850nm的可见光区,紫外分光光度计的应用波长范围为200-400nm的紫外光区。由于各种物质吸光度不一样,有些物质的吸光度在可见光区,则要用可见分光光度计;有些物质的吸光度在紫外光区,则要用紫外分光光度计。 (3)方法步骤:①稀释淀粉酶蛋白质溶液。准确吸取0.1mL淀粉酶蛋白质,置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度(即500倍);②测定光密度。在紫外分光光度计上,将稀释的蛋白质溶液倒入石英比色杯中,用生理盐水做对照,测得280nm和260nm两个波长的光密度;③计算蛋白质含量。将测得280nm和260nm波长的光密度值按经验公式:蛋白质浓度(mg/mL)=1.45
D280
一0.74
D260
,计算蛋白质浓度,再根据溶液体体积计算出蛋白质含量。
【答案解析】