为了研究细胞内与蛋白质A结合的mRNA所包含的功能基因信息，一般将mRNA反转录成稳定的DNA双螺旋（cDNA），再插入到可以自我复制的载体中。一个高质量的cDNA文库代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息。实验方法包括：总RNA提取、mRNA的纯化、cDNA的合成、cDNA文库的构建以及基因文库的筛选。

（1）总RNA的提取

总RNA是指细胞内全部RNA的总称，包括mRNA、rRNA、tRNA以及一些小RNA（sRNA）。目前实验室常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法，Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。其提取过程如下：

①用液氮研磨材料至成为匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分；

②加入氯仿抽提，离心，分离水相和有机相；

③收集含有RNA的水相，通过异丙醇沉淀，获得比较纯的总RNA。

最后用琼脂糖凝胶电泳检测RNA。

（2）mRNA的纯化

实验中常用寡（dT）-纤维素柱层析法获得高纯度mRNA。

该方法利用mRNA3＇末端含有poly（A）的特点，当RNA流经寡（dT）-纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异性地结合在柱上，再用低盐溶液或蒸馏水洗脱mRNA。经过两次寡（dT）纤维柱后可得到较高纯度的mRNA。

实验中常用poly AT Tract mRNA分离系统将生物素标记的寡（dT）引物与细胞总RNA温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白以结合polyA mRNA，通过磁场吸附作用将poly（A）mRNA从总RNA中分离。

（3）cDNA的合成

①第一链cDNA的合成

以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引物引导，常用的引物是oligo（dT）。

②第二链cDNA的合成

常用RNaseH切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物，以第一链为模板，由DNA聚合酶催化合成第二条cDNA的片段，再通过DNA连接酶的作用连成完整的DNA链。

（4）cDNA文库的构建

①cDNA文库的载体选择

根据该文库的用途确定，常用载体有质粒和噬菌体。

②以噬菌体作为载体的cDNA文库

含有cDNA插入片段的重组噬菌粒只有经过体外蛋白外壳包装反应，才能成为有侵染和复制能力的成熟噬菌体。

（5）基因文库的筛选

基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法：

①核酸杂交法

常用放射性标记的特异DNA探针进行高密度的菌落杂交筛选。