以pBR322质粒为例说明插入失活选择法的原理以及选择过程。
 
【正确答案】(1)插入失活选择法的原理 插入失活是指把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活,丧失其原有的表性特征的方法。标记基因多为抗生素抗性基因。 pBR322质粒上包括两个抗菌素抗性基因:来源于pSE2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因(ampr)和来源于pSC101质粒的四环素抗性基因(tetr)。 ①氨苄青霉素抗性基因:产生β-内酰胺酶,使氨苄青霉素转变为青霉噻唑酸,使碘-青霉素指示液(蓝灰色)褪色。 ②四环素:抑制细菌生长,但不杀死细菌。 ③环丝氨酸:杀死生长的细菌,但不杀死停止生长的细菌。 (2)插入失活选择法的选择过程 ①氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果ampr上插入外源DNA,导致氨苄青霉素抗性基因失活,可用碘-青霉素指示液选择。 ②四环素抗性插入失活选择过程 如果在tetr上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活,可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。tetr失活的菌生长被四环素抑制,不被环丝氨酸杀死,保留下来;tetr不失活的菌抗四环素,能分裂生长,反而被环丝氨酸杀死。
【答案解析】