结构推理 总RNA的分离纯化有哪些方法?
【正确答案】(1)(异)硫氰酸胍一酚氯仿一步法:(异)硫氰酸胍一酚氯仿法是经典的一步法,用于从培养细胞和大多数动物组织中分离纯化总RNA。它以含4mmol/L的(异)硫氰酸胍与0.1mmol/L的B一巯基,乙醇变性溶液裂解细胞,然后在pH4.0的条件下,用酚/氯仿抽提裂解溶液,最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得RNA。本法与(异)硫氰酸胍一CsCl超速离心法相比,具有简便、经济和高效的特点,能同时迅速地处理多个标本,且RNA的完整性与纯度均很高。总RNA的产量取决于标本的起始量,每毫克组织大约能获得4~7ug总RNA,每10的6次方个细胞大约获得总RNA5~10ug。但该法不适合从富含甘油三酯的脂肪组织中提取RNA,而且有时RNA会带有多糖和蛋白多糖的污染,这些污染将影响乙醇沉淀后RNA的溶解和抑制RT-PCR反应。污染物还会结合到膜上而影响RNA杂交。脂肪组织中RNA的提取可换用(异)硫氰酸胍一CsCl超速离心法,当多糖与蛋白多糖的污染比较严重时,可通过增加有机溶剂的抽提步骤并改变RNA的沉淀条件而加以消除。(2)同时制备RNA、DNA与蛋白质的一步法:本方法是(异)硫氰酸胍一酚氯仿一步法的改进方法。它是以(异)硫氰酸胍.酚的单相裂解试剂裂解细胞,再加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质位于两相的界面,保留于上层水相的RNA在RNA沉淀溶液中通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而获得。RNA沉淀溶液的成分为1.2mmol/LNaCl与0.8mmol/L柠檬酸二钠,可使RNA样品极少有多糖与蛋白多糖的污染,可用于mRNA的纯化、Northern杂交、逆转录和RT-PCR反应等。处于界面的DNA与蛋白质可通过乙醇和异丙醇分级沉淀出来。该法制备的DNA可作PCR反应的模板,蛋白质样品则用于免疫印迹。目前,该法已有多种商品化的单相裂解试剂供选择,已成为最常用的总RNA提取法,其产量与(异)硫氰酸胍一酚氯仿一步法相当。(3)其他方法:RNA的分离纯化方法还有许多,如(异)硫氰酸胍一CsCl超速离心法、盐酸胍.有机溶剂法、LiCl一尿素法和热酚法等,因各种原因这些方法目前已较少使用。
【答案解析】