【正确答案】(1)酵母单杂交系统 ①基本原理 将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游。然后将编码待测转录因子的cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。 ②应用 a.用于确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用,并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因; b.鉴别DNA结合位点,并发现潜在的结合蛋白基因; c.对DNA结合结构域进行分析,进一步准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 (2)酵母双杂交系统 ①基本原理 a.把编码已知蛋白的DNA序列连接到带有酵母转录调控因子DNA结合结构域(BD)编码区的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂合蛋白,与报告基因上游的启动调控区相结合,准备作为“诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。 b.将已知的编码转录激活结构域(AD)的DNA分别与待筛选的cDNA文库中不同插入片段相连接,获得“猎物”载体,转化含有“诱饵”的酵母细胞,一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物”载体中表达的某个蛋白质发生相互作用,不同转录调控因子的AD和BD结构域就会被牵引靠拢,激活报告基因表达。 c.分离有报告基因活性的酵母细胞,得到所需要的“猎物”载体,就能得到与已知蛋白相互作用的新基因。 ②应用 用于:a.研究蛋白质之间的相互作用;b.发现新的蛋白质和蛋白质的新功能;c.在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用;d.疾病发生机制的研究和药物的开发;e.建立基因组蛋白连锁图;f.确定蛋白质相互作用的结构域或活性位点。
【答案解析】