问答题
试题分析举例
酶纯化实验中,通常用(NH4)2SO4,请问:
(1)与其他中性盐沉淀剂相比,(NH4)2SO4用做沉淀剂有何优点?
(2)如发现层析后酶的总活性较纯化前明显升高,可能的原因是什么?
(3)柱层析时,湿法装柱注意事项主要有哪些?
【正确答案】(1)用盐析法沉淀蛋白质是通过中性盐破坏蛋白质分子表面水化层、降低蛋白质溶解度来实现的。中性盐影响蛋白质溶解度的能力是其离子强度有的函数。与KCL、NaCl等相比,(NH4)2SO4用做沉淀剂的优点是:它是二价离子中性盐,而且在水中溶解度很高,溶解度的温度系数也较低,故能在低温下(4℃)以高浓度存在,争夺溶液中的水以及蛋白质分子表面结合的水分子,使蛋白质溶解度有效降低,从而使蛋白质在保持活性的情况下从溶液中沉淀出来。
(2)层析后酶活性明显提高,最可能的原因是:在层析前,酶溶液成分复杂,可能含有某种抑制酶的物质,当用层析法将酶分离后,抑制因子被清除,所以表现出总活性升高。
(3)湿法装柱就是将填料充分用溶剂(如水)溶胀后再装入层析柱中。应注意:在层析柱中事先装入少量水的情况下将填料边搅边倒,以避免柱床内产生气泡;倒入填料时要连续一次性完成,以避免柱床出现分层;层析柱要垂直,以避免柱床表面凹凸不平;柱填料应始终浸泡在水中,以防止干燥和柱床发生裂缝。
【答案解析】