问答题 小鼠胚胎细胞成纤维细胞细胞系10T1/2是一个非常稳定的细胞系，它的细胞以及细胞的行为看起来都与正常成纤维细胞相似。如果这些细胞在含5'-氮化胞苷的培养基中培养24小时，随后当它们长到很高的密度时，用5'-Azac处理会降低DNA甲基化的正常水平，使原先没有活性的基因活化为开放基因。它们将分化为软骨细胞、肥大细胞和肌肉细胞。如果这些细胞用5'-AzaC处理过后，在低细胞浓度下生长，它们保持原有成纤维细胞的特性，但是当生长许多代后，细胞达到高密度时又会分化。10T1/2细胞如果不曾用5'-氮化胞苷处理过，无论细胞浓度如何都不会引起分化。
   当处理过的细胞分化时，大约25/%的细胞转变为肌肉细胞(肌原纤维)，肌原细胞形成的高频率导致一种假说的建立，一个独立的主调控基因，它正常情况下由于甲基化受到抑制，它可以启动完整的转化。估计这个基因在用5'-氮化胞苷处理前是处于关闭状态，而在诱导的肌原细胞中呈开放状态。如果这个设想是真的，在用5'-氮化胞苷处理后的mRNA的cDNA拷贝中应能找到与这个用5'-AzaC处理后就开始启动的基因有关的序列。对策是应用一套放射性探针从正常肌原细胞(这种细胞按照你的设想也能表达这个基因)获得的cDNA文库中挑选可能的cDNA克隆。应准备三种放射性探针：
   探针1：从5'-氮化胞苷诱导的肌原细胞中分离RNA，制备含放射性的cDNA探针。
   探针2：用5'-AzaC处理的肌原细胞中的有放射性的cDNA与未经处理的10T1/2细胞中的RNA进行杂交，除去所有的RNA和DNA杂合体。
   探针3：从正常的肌原细胞中分离RNA，制备放射性DNA探针，然后与未经处理的10T1/2细胞中的RNA杂交，除去所有的RNA和DNA杂合体。
   第一个探针同cDNA文库中的大多数克隆发生了杂交，但是这些克隆中只有约1/%的克隆与探针2或探针3进行杂交。总之，有四种独特的杂交模式(表13-3-54)。
   
表13-3-54
Class Probe 1 Probe 2 Probe 3
A
B
C
D		 +
+
+
+		 —
—
+
+		 —
+
—
+
【正确答案】探针2和3有用。因为它们对于mRNA是特异性的，你正在寻找一种mRNA，它存在于两种细胞中，但是在10T1/2细胞中不存在。用来自10T1/2细胞中的RNA与具有放射性的细胞cDNA进行杂交的原因是为了从探针中移去所有那些与mRNA有关，介于10T1/2和细胞间的相似序列。这种杂交过程使探针的特异性更强，可避免分析大量的cDNA克隆，而这些克隆是你认为没有含有你感兴趣基因的。
【答案解析】
【正确答案】A组克隆包含与介于10T1/2细胞间的RNAs有关的cDNAs，在这组中是持家基因，这组克隆是负杂交所要排除的，既然探针2和3仅同探针1所确定的1/%的cDNA克隆杂交，这些持家RNAs一定代表细胞中大量的mRNA。
   B组克隆包含与RNAs相关的cDNAs克隆。这些RNAs由5-AzaC诱导处理。但是在正常的细胞或10T1/2细胞中并不存在。既然5'-AzaC能导致广泛的去甲基化，它能激活一些在成肌细胞中正常情况下不表达的基因也就不足为奇。
   C组克隆包含与RNAs有关的cDNAs，这些RNAs在正常的成肌细胞中存在，但在5'-azaC诱导的成肌细胞中不存在。如果诱导的成肌细胞同正常的成肌细胞一致，这组克隆将不存在。因而很自然怀疑在诱导的成肌细胞中存在一些缺失，然而，问题看来存在于正常的成肌细胞当中。正常的成肌细胞包含一个小片段，然而诱导细胞中不存在。从正常成肌细胞中分离的RNA包含各种不同细胞型的RNA。当分析时，C组克隆被发现编码肌肉特异性基因产物，如肌钙蛋白Ⅰ等。
   D组克隆包含与成肌细胞特异性RNAs有关的cDNAs，你希望在这之中找出与成肌细胞分化控制有关的调控基因。
   真实控制成肌细胞分化的调控基因在这组克隆中发现。通过进一步的实验，从这组克隆中分离出了这种基因，这些实验基于以下的假设：①调控基因在所有10T1/2细胞中不被表达；②在成肌细胞中它的表达量具有最大值；③它的表达在成肌管中下降；④在用5-AzaC正处理的未分化的10T1/2突变体细胞中不表达。最后的实验，当克隆的cDNA被导入10T1/2细胞中时，它将诱导其分化为成肌细胞。结果也的确是这样。
【答案解析】