检验细胞活性的荧光显微的方法如下:
(1)基本原理
一些荧光染料对死细胞和活细胞有不同的作用效果,因此可以利用荧光显微镜观察方法来检验细胞活性。如碘化丙锭(PI)被活细胞排斥但能穿过死亡或已经死亡细胞的细胞膜,因此活细胞不被染料染上色,只有死细胞或凋亡细胞才能染上红色。
(2)主要步骤
①固定。培养细胞的制片或冰冻切片用4%多聚甲醛固定30min(4°C)后,用80%酒精再固定2h(-20°C)。常规4%中性福尔马林固定、石蜡包埋切片进行脱蜡、水化。
②洗涤。玻片浸入PBS缓冲液,摇床上洗涤5min,3次。
③反应。洗涤后的玻片用吸水纸吸干细胞或组织周围水分,按50μL/cm2滴加反应液,使反应液均匀地覆盖于所有细胞或组织切片上,盖上盖玻片,37°C孵育1h。
④终止反应。去掉盖玻片,将玻片置于有洗涤缓冲液的染色缸内,洗涤2次,每次5min。
⑤FITC标记。洗涤后的玻片用吸水纸吸去细胞或组织周围水分,按50μl/cm2滴加FITC反应液,室温下避光孵育10min。
⑥洗涤。将玻片置于洗涤缓冲液内,洗两次,每次5min。
⑦PI复染。将玻片置于有PI染液的染色缸内,室温下避光染色30min.
⑧封片。用盖玻片直接盖在含PI染液的玻片上,亦可用无色指甲油涂于盖玻片四周边缘,置暗盒中,尽早镜检观察。
⑨结果判定。用荧光显微镜观察,选用蓝色激发光(波长488nm),所有细胞核均被PI着色,显示出红色荧光,而凋亡细胞被特异地标记上FITC,显示出黄绿色荧光。