实验题

根据所学的知识回答:
1)什么是RNAi技术?请问可以设计什么实验检测RNAi的效率?
2)什么是MTT assay,它的作用原理是什么?
3)请列举其他检测细胞增殖水平的方法,简要说明。

【正确答案】

1)RNAi及RNA干扰,是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。可以通过提取mRNA,然后反转录成cDNA,再通过荧光定量PCR确定cDNA量,就可以检测到RNAi的效率。
2)MTT实验是一种检测细胞存活和生长的方法。
原理:MTT是一“种黄颜色的染料”。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MIT,同时在细胞色素C的作用下,生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazan),甲臜的多少可以用酶标仪在570nm处进行测定。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶,因此加入MT不会有反应。
3)①胸腺嘧啶核苷(3H-TdR) 渗入法
胸腺嘧啶核苷(TdR) 是DNA特有的碱基,也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DAN合成代谢过程,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DAN的代谢及细胞增殖情况。但是具有放射性。
②羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料,具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团,使CFSE成为一种良好的细胞标记物。CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时,CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中,因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样,在一个增殖的细胞群中,各连续代细胞的荧光强度呈对递减,利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。
③Brdu检测法
Brdu中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷,为胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活体注射或细胞培养加入,而后利用抗Brdu单克隆抗体,ICC染色,显示增殖细胞。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。

【答案解析】