（1）以腺病毒为例进行载体构建的策略

①基因调取与腺病毒穿梭质粒的构建

针对感兴趣的基因，从NCBI网站上得到目的基因CDS区信息并设计引物，从文库中调出基因，克隆至腺病毒系统穿梭载体（Pshuttle-CMV）。如需克隆的为基因突变体，则将基因克隆至穿梭载体后，行若干次点突变，至得到需要的突变体为止。

②腺病毒骨架质粒的同源重组

将携带目的基因片段的穿梭质粒线性化后与腺病毒大骨架质粒共转入在特定的大肠杆菌中进行同源重组，由于腺病毒骨架质粒是氨苄抗性，而与穿梭质粒同源重组后，氨苄抗性丢失，同时表达卡那霉素抗性，因此，通过抗性的变化可筛选出腺病毒载体骨架重组子，挑取重组子进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的克隆，进行下一步腺病毒载体的包装。

③腺病毒载体的包装与扩增

将筛选到的重组腺病毒运用脂质体法转染到293细胞中，由于腺病毒载体基因组中的早期基因E1缺失，利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞，一至两周即可包装出E1缺失的腺病毒载体，通过倍比扩增，富集病毒颗粒。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100%的感染效率。

（2）载体构建策略的应用

①癌症的基因治疗。正在使用中的治疗方法可分为三类：

a．肿瘤抑制基因或肿瘤消除基因；

b．可溶解肿瘤和增强药物敏感性的治疗；

c．疫苗。

②遗传疾病的基因治疗。为了修复导致肌肉萎缩症的基因缺陷，大量地尝试了腺病毒载体的使用。一个犬模型系统也显示出免疫反应的重要影响，因为用腺病毒递送了dystrophin基因后再用环孢菌素治疗得到了更为持久的肌肉功能的改善。

③其他疗法。随着高龄人口的增加，对于人神经退化疾病如帕金森氏病的治疗提出了一个重要的挑战。腺病毒，因其可以感染有丝分裂后的细胞，同时具有潜在的高转导效率和在中枢神经系统免疫特惠区中的低病原性，因此是进行神经疾病基因治疗的有效载体。