问答题 试述基因表达系列分析的原理及其基本过程。
【正确答案】基因表达系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)以逆转录产物cDNA上特定区域的9~11bp特异寡核苷酸序列作为标签(tag)来代表各转录物;用连接酶随机串联将多个标签(20~60个)并克隆到载体中,建立SAGE文库;通过对标签的序列分析,获得基因转录的分布以及表达丰度,从而充分了解基因转录组的全貌。SAGE的基础是能特异性代表转录物并含有足够信息的标签。
   SAGE的基本过程是:1)先通过oligo(dT)将mRNA逆转录获得单链cDNA,然后以生物素标记的、核心序列为tag的特异性引物单链扩增获得双链cDNA(不改变基因表达丰度);2)用锚定酶(anchoring enzyme,AE)获得特异性DNA末端:一般采用具有4bp识别位点的限制性核酸内切酶NlaⅢ消化;3)消化后通过生物素与抗生物素蛋白结合,分离cDNA,得到的cDNA片段分为两组,分别与接头A和B连接(接头A和B的5'端分别为NlaⅢ黏性末端,3'端分别为非NlaⅢ的某限制性酶黏性末端),二者分别含有PCR引物A和B互补结合序列;4)经T4 DNA连接酶连接cDNA片段,形成两端分别带有连接子A、B的标签二聚体;5)以引物A和B(应稍长于接头A和B,覆盖完整的NlaⅢ位点及其旁侧保护序列)扩增二聚体,产物再以锚定酶消化,纯化后连接成为标签二聚体的串联体,可长达30~40 EST,克隆到载体上,进行DNA序列测定。一种标签的丰度即反映相应转录物的转录水平。可获得疾病组织中基因表达的全貌;或与正常组织对照分析,发现新的疾病基因或相关基因,并确定特定基因在疾病发生中的作用。
【答案解析】