【正确答案】正确答案：(1)第一种方法：考马斯亮蓝法。在加有该生物分子的试管中加入考马斯亮蓝溶液，如果考马斯亮蓝溶液由红色变为青色，则证明该生物分子为蛋白质。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质一色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。 第二种方法：双缩脲法。在加有该生物分子的试管中先加入NaOH溶液(2mL)，振荡摇匀，形成碱性的反应环境，然后再加入3-4滴CuSO ₄ 溶液，振荡摇匀后观察现象，如果看到紫色，则证明该生物分子为蛋白质。双缩脲反应是在碱性环境下的Cu ²⁺ 与双缩脲(H ₂ NOC—NH-CONH ₂ )发生的紫色反应。而蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，所以蛋白质都能与双缩脲试剂发生颜色反应，可以用双缩脲试剂鉴定蛋白质的存在。 (2)SDS-PAGE主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，。而电荷因素可以被忽略。根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，即可求得未知物的分子量。 凝胶过滤法是一种高效分离纯化蛋白质的方法，其原理是不同的蛋白质分子对固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价链接。将这种有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其他蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。从凝胶过滤的原理可知，蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯笃克半径，利用凝胶过滤法测定蛋白质分子量时，标准蛋白质(已知分子量和斯笃克半径)和待测蛋白质必须具有相同的分子形状(接近球体)，否则不能得到比较准确的分子量。 因此，该分子可能与标准蛋白质的分子形状差别比较大，故用凝胶过滤法无法得到准确的分子量，而使用SDS-PAGE的方法测得的结果比较可靠。 (3)大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，备受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系，所以用大肠杆菌来表达该蛋白质是非常理想的选择。 往该蛋白质分子末端连接6个His残基利于纯化。组氨酸在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子，如Ni ²⁺ 、Zn ²⁺ 和Co ²⁺ 相互作用，是应用最为广泛的亲和标签。连接6个His残基的分子量最小，不影响目标蛋白的功能；His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者存纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯合亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其他蛋白的干扰，或进行金属螯合亲和层析复性，在提纯蛋白质时起很大作用。