问答题
以pBR322 DNA作为载体,从四环素抗性基因区克隆外源DNA时,可采用环丝氨酸富集法筛选重组体,说明其基本原理和基本操作过程。
【正确答案】原理:
由于四环素的作用只是抑制细菌蛋白质的合成,而不是杀死细菌;而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺入蛋白质则是致命的。因此在有四环素的条件下,环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌。经过环丝氨酸处理后,存活的细胞中tets型得到很大富集,而经过若干次连续处理,即能获得在tetr基因内含有插入物的质粒的细胞。
基本操作:
(1)转化后有三种表型的细菌,其中只有一种是重组体:AprTcs。
(2)用重组DNA转化受体菌后,将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培养液中培养;此时只有非重组的双抗性菌可以生长,其他都被抑制。
(3)由于有环丝氨酸的存在,AprTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡。
(4)由于四环素只有抑菌而无杀菌作用,此时若解除四环素(离心洗涤),加入氨基苄青霉素继续培养,则可使重组体大量生长。
【答案解析】