【正确答案】cDNA文库是指以细胞的全部mRNA逆转录合成的cDNA组成的重组克隆群体。从cDNA文库可以获得较完整的连续编码序列(不含内含子),便于表达成蛋白质。cDNA文库的构建过程如下: (1)总RNA的提取 常用异硫氰酸胍-苯酚抽提法提取总RNA。 (2)mRNA纯化 常用寡(dT)-纤维素柱层析法获得高纯度的真核mRNA。 (3)cDNA第一链合成 以mRNA为模板,由反转录酶催化反转录成cDNA,需要引物oligo(dT)。 (4)cDNA第二链合成 常用RNase H切割mRNA-cDNA杂合链中的mRNA序列产生的小片段为引物,以第一链为模板,由DNA聚合酶催化合成第二条cDNA的片段,再通过DNA连接酶的作用连成完整的DNA链。 (5)载体与cDNA的连接 常用的载体有质粒和噬菌体。载体与cDNA连接的方法包括人工接头、同聚物加尾、cDNA定向插入。 (6)重组cDNA分子转移和文库的建立 ①噬菌体作为载体需要经过体外包装和转染。 ②质粒作为载体,可直接转化大肠杆菌。
【答案解析】