结构推理 比较两种DNA快速测序的方法,包括方法的原理和优缺点。
【正确答案】目前应用的两种快速序列测定技术是Sanger等提出的酶法(双脱氧链终止法)和Maxam提出的化学降解法。
   双脱氧末端终止法是Sanger等在加减法测序的基础上发展而来的。其原理是:利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ,以单链DNA为模板,并以与模板事先结合的寡聚核苷酸为引物,根据碱基配对原则将脱氧核苷三磷酸(dNTP)底物的5'-磷酸基团与引物的3'-OH末端生成3',5'-磷酸二酯键。通过这种磷酸二酯键的不断形成,新的互补DNA得以从5'→3'延伸。Sanger引入了双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂。ddNTP比普通的dNTP在3'位置缺少一个羟基(2',3'-ddNTP),可以通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中,但由于缺少3'-OH,不能同后续的dNTP形成3',5'-磷酸二酯键。因此,正在增长的DNA链不再延伸,使这条链的延伸终止于这个异常的核苷酸处。这样,在4组独立的酶反应体系中,在4种dNTP混合底物中分别加入4种ddNTP中的一种后,链的持续延伸将与随机发生却十分特异的链终止展开竞争,在掺入ddTNP的位置链延伸终止。结果产生4组分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G和每一个T位置上的一系列长度的核苷酸链。通过高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,从放射自显影胶片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。
   化学降解法与包括合成反应的链终止法不同,需要对原DNA进行化学降解。其基本原理是,首先对待测DNA末端进行放射性标记,再通过5组(也可以是4组)相互独立的化学反应分别得到部分降解产物,其中每一组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割。因此,产生5组(或4组)不同长度的放射性标记的DNA片段,每组中的每个片段都有放射性标记的共同起点,但长度取决于该组反应针对的碱基在原样品DNA分子上的位置。此后各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,通过放射自显影检测末端标记的分子,并直接读取待测DNA片段的核苷酸序列。
   虽然其原理大相径庭,但这两种方法都同样生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组核苷酸都有共同的起点,却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列以某一特定核苷酸为末端的长度各不相同的寡核苷酸混合物,这些寡核苷酸的长度由这个特定碱基在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,经放射自显影后,从放射自显影胶片上直接读出待测DNA上的核苷酸顺序。Sanger法测序快速、方便,测序片段长,但有时会出现一些不够清晰的结果。化学降解法可提供比较清晰的结果,但步骤繁琐,许多药品有剧毒。
【答案解析】