问答题

请说明免疫荧光细胞化学中荧光抗体示踪(免疫荧光细胞化学)的技术原理、方法与实验步骤及其在细胞生物学研究中的应用。

【正确答案】

技术原理:免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色),可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。
方法:免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性,所以当抗原抗体发生反应时,只要知道其中的一个因素,就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体(或抗原)上,与其相应的抗原(或抗体)结合后,在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
实验步骤:1.细胞爬片;2.4%多聚甲醛固定10分钟(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮);3.PBS漂洗;4.0.5%Triton通透穿孔;5.PBS漂洗6.1%BSA封闭;7.加入1%BSA稀释的一抗,于37度杂交;8.PBS漂洗;9.加入1%BSA稀释的二抗,于37度杂交;10.PBS漂洗;11.5μg/ml DAPI染色;12.抗猝灭封片剂封片13.观察。
应用:免疫细胞化学技术与亲和化学技术如葡萄球菌A蛋白、生物素、与卵白素、植物血凝素相结合拓宽了领域;与激光技术、电子计算机和扫描电镜等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术;荧光激活细胞分类器(FACS)的应用是免疫荧光细胞化学技术发展到更高的阶段,开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。在免疫荧光细胞化学中应用单克隆抗体日益增多,将会不断提高特异性、敏感性和应用范围。激光扫描等聚焦显微镜的应用又开创了新的发展时代。
由于免疫荧光细胞化学的特异性、快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性,在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学、以及临床检验学等生物学和医学许多方面得到广泛应用,日益发挥重要作用。

【答案解析】