【正确答案】(1)抗生素抗性基因插入失活法;(2)β-半乳糖苷酶基因失活插入法;(3)放射性标记核酸探针杂交法。
【答案解析】[考点]目的基因的筛选。目的基因的筛选的方法主要有:
(1)抗生素抗性基因插入失活法:很多质粒载体都带有一个或多个抗生素抗性基因标记,在这些抗药性基因内有酶的识别位点,当用某种限制酶消化并在该位点插入外源目的DNA后,抗药性基因不再被表达,称为基因插入失活。因此,当此插入外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时,对该药物由抗性转为敏感,便可筛选出携带目的DNA的克隆。
(2)B-半乳糖苷酶基因失活插入法:许多载体都带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子DNA区段,其中含有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的前146个氨基酸编码信息(lacZ')和调控序列(lacⅠ),还插入一个多克隆位点(不破坏阅读框)。这一区段编码β-半乳糖苷酶N端的一个片段(无酶活性)。而宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端部分片段(也没有酶活性),但两者之间可以实现基因内互补(称为-互补)从而融为一体,形成具有酶活性的蛋白质。由-互补而产生的Lac+细菌在诱导物IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)和x-gal(5-溴-4-氯3'-吲哆-β-D-硫代半乳糖苷)存在时形成蓝色菌落。但是,当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后,使LacZ的N端片段失活,破坏了互补作用,因此,带有重组质粒的细菌将产生白色菌落,而不带有重组体的或为重组成功的则为蓝色。
(3)放射性标记核酸探针杂交法:通过与放射性标记的探针杂交后,进行放射自显影能够确定携带外源DNA的重组体。