（1）革兰氏染色机理与步骤如下：

①机理

通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞膜内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物。革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇乙醇或丙酮作脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色。反之，革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层的类脂含量高、肽聚糖层薄和交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此，通过乙醇脱色后细胞退成无色。这时，再经沙黄等红色染料进行复染，就使革兰氏阴性菌呈现红色，而革兰氏阳性菌则仍保留紫色。

②步骤

结晶紫初染→碘液媒染→乙醇或丙酮脱色→沙黄等红色染料复染。

（2）关键步骤是乙醇脱色

乙醇脱色的时间应严格控制，一般控制在1min左右。如果脱色过度，有可能使革兰氏阳性菌呈假阴性；如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。

（3）有能够省略的步骤。

可以省略“媒染”这一步。碘液媒染是为了使初染染料较为稳定地结合，因此当用革兰氏染色法对某些菌染色时，如果这种菌本身就能够与结晶紫结合地足够紧密，就可以省去媒染这一步，使洗脱更易进行。