研究蛋白质与DNA相互作用的方法主要有哪些?详述其中一种的原理和步骤。
 
【正确答案】(1)研究蛋白质与DNA相互作用的方法 凝胶阻滞(EMSA)实验、DNase Ⅰ足迹法、酵母单杂交技术、染色质免疫共沉淀(ChIP)技术、甲基化干扰试验和体内足迹试验等。 (2)酵母单杂交系统 酵母单杂交系统是用于研究DNA-蛋白质之间的相互作用的方法,可通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 ①原理 真核生物基因的转录起始需转录因子参与,转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成,即DNA结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD)。将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游,然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞,该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合,就能激活Pmin启动子,使报告基因得到表达。 ②步骤 a.构建报道子载体。将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最基本启动子(Pmin)的上游,把报告基因连接到Pmin下游。 b.筛选含有报道子载体的酵母细胞。将构建好的报道子载体转化酵母细胞并筛选合适的3-AT浓度。 c.构建cDNA表达文库。将样品经过一定处理之后,提取mRNA,经过反转录获得cDNA。 d.筛选cDNA融合的表达文库。将报道子、cDNA和融合表达载体共转化到酵母中,在相应的SD培养基上筛选阳性克隆。 e.对阳性克隆进行鉴定,去除假阳性克隆。 f.对获得的阳性克隆进行测序。
【答案解析】