结构推理 基因克隆的方法主要有哪几种?简述各种方法的原理和用途。
【正确答案】(1)RACE技术
   基本原理:根据已知序列设计基因片段内部特异引物,由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5'端的方法称为5'RACE,用于扩增3'端的称为3'RACE。
   用途:是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法。
   (2)应用cDNA差示分析法克隆基因
   基本原理:该法充分发挥了PCR技术以指数形式扩增双链DNA模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异性扩增目的基因片段。因为试验对象和供试探针在接受差示分析前均经一个4碱基切割酶处理,形成平均长度256bp的代表群,保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸,94℃复性这两个参数共20个PCR循环,PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。
   用途:对染色体步移技术、定位克隆技术、cDNA差显技术等方法的补充。
   (3)Gateway大规模克隆技术
   基本原理:利用入噬菌体进行位点特异性DNA片段重组,通过整合与切出反应,实现基因快速克隆和载体间平行转移。
   用途:为大规模克隆基因组注释的可译框架提供了保障。
   (4)基因的图位克隆
   基本原理:首先,通过构建遗传连锁图,将目的基因定位到某染色体的特定位点,并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。其次通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析,找出与目的基因距离最近的RFLP标记,通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。然后,根据基因功能互作原理鉴定目的基因。
   用途:分离未知性状的目的基因。
【答案解析】