蛋白质Pull-down实验原理与主要步骤。
 
【正确答案】(1)实验原理:通过与GST融合蛋白质探针蛋白质相互作用从可溶性蛋白质库中亲和纯化一个未知蛋白质,再通过GST与谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的结合收集相互作用蛋白质,从而分离出蛋白质复合物。 (2)主要步骤:①GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育(a.单一明确的重组蛋白;b.细胞裂解蛋白混合液;c.体外翻译cDNA表达得到的未知蛋白);②混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠在4℃反应2 h;③离心弃上清;④沉淀加入2×蛋白Loading Buffer煮沸,离心;⑤取上清进行SDS-PAGE电泳;⑥考马氏亮兰染色观察特异沉降的蛋白带,进一步做质谱分析确定沉降的蛋白;电泳后的胶也可以做Western Blot来确定沉降的蛋白中是否有目的蛋白。
【答案解析】