问答题 如何克隆一个基因?然后如何研究该基因的基本功能?

【正确答案】(1)基因克隆:
1)选取感兴趣的基因高表达的组织或细胞,提取RNA,随机引物进行反转录得到cDNA,依据感兴趣基因两端的序列设计引物(两端有酶切位点),用反转录所得cDNA作模板进行PCR,扩增感兴趣目的基因,对纯化的PCR产物及选好的合适克隆载体进行酶切,凝胶电泳回收,连接,转化入宿主细胞(一般为大肠杆菌),在抗性平板上筛选,挑取克隆进行鉴定(提取质粒酶切验证或用针对cDNA设计的PCR引物进行菌落PCR筛选)。将正确的菌体克隆中的质粒提取纯化,记得到感兴趣基因的克隆。
2)用1)鉴定正确的质粒转化表达型宿主细胞,诱导表达大量目的基因产物(如多数质粒载体都可用IPTG诱导),SDS-PAGE鉴定目的蛋白是否已表达且大小符合预期,大量表达,收集宿主菌体,超声破碎细胞,用层析等方法纯化蛋白,即得大量目的蛋白。
(2)功能研究:①体外,以所获目的蛋白为诱饵进行酵母双杂交,了解此蛋白质与已知功能的蛋白间的相互作用情况,初步预测了解其功能;②利用纯化的蛋白制备抗体,对不周组织活细胞进行Western Blot实验,观察其表达特异性;③可进行转基因实验进行过表达或RNAi,从上调和下调两个角度了解此蛋白在活体的功能。
【答案解析】