亚慢性毒性试验的剂量，上限应控制在试验动物接触受试物的整个过程中不发生死亡或仅有个别动物死亡，但要有明显的中毒效应或靶器官出现典型的损伤，上限剂量的确定可参考急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量，或以该化学物LD₅₀值的1/20～1/5为最高剂量。中剂量组动物以出现轻微中毒效应为度，相当于亚慢性毒性的阈剂量。低剂量组不产生任何毒效应，剂量相当于亚慢性的最大无作用剂量水平。各剂量组间剂量差至少应大于2倍。