问答题 反转录酶有两种类型:①来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(avian myeloblastosis viru,AMV);②来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(Moloney murine leukemia viru. M-MLV)。它们之间有什么不同?
【正确答案】(1)AMV反转录酶是一个二聚体(α=62kDa,β=94kDa),具有5'→3'合成酶和很强的RNase H活性。M-MLV反转录酶是一条多肽链,分子质量为84kDa,具有5'→3'合成酶和较弱的RNase H活性。当用长的RNA合成互补的cDNA时,这种较低的RNase H活性很有利。反应开始时,引物与RNA模板形成的杂交体正是RNase H的底物,故cDNA合成一开始就存在mRNA模板降解和DNA合成起始之间的相互竞争。另外,如果反转录酶在合成过程中暂停作用,RNase H就会在DNA链3'端附近切割mRNA模板,因此禽酶的高RNase H活性会影响cDNA的产量和长度。
   (2)在反应温度上,AMV反转录酶为42℃,M-MLV则是37℃。鼠酶在42℃下会迅速失活,因此对复制富含二级结构的RNA来说,使用禽酶的效率高于鼠酶。但要注意,禽酶制品中常含有切割DNA的内源核酸酶活性。
   (3)反应的最适pH:AMV反转录酶为8.3,M-MLV反转录酶为7.6。两种酶对pH都非常敏感,即使误差为0.2,反应产物也会大大缩短。由于Tris缓冲液的pH随温度变化而变化,因此在实验中必须校正pH。
   (4)DNA内切核酸酶的活性:在Mn2+存在时,AMV反转录酶能够切割单链DNA,这种活性无专一性位点,对热稳定。而M-MLⅣ反转录酶没有此活性。
【答案解析】