问答题
在进行遗传重组和基因克隆与表达的研究中,对分子克隆的载体与宿主系统的选择有非常重要的作用。请论述各主要载体系统的特点及宿主系统。
【正确答案】(1)载体的要求:具有自主复制的DNA元件,可以独立于宿主基因组之外进行复制与分离。具有选择性标记,可使含有该载体的宿主与不含该载体的宿主区别开来,一半是抗性基因。此外作为分子克隆的载体常需具备可插入外源片段的多克隆位点。
(2)常见载体:①质粒载体,最经典常用的载体,但需注意抗性筛选得到的载体是否已插入目的片段;②入噬菌体载体,可插入20kb片段,用于克隆纯化DNA片段、cDNA文库构建等;③黏粒噬菌体,可插入50kb片段,用于构建文库;④M13噬菌体,可产生单链重组DNA,方便测序和定点突变;⑤人工染色体(包括YAG、BAC等))用于构建基因组文库的大片段载体。BAC可克隆200~300kb片段,YAC可克隆1Mb左右片段,但不如BAC稳定易操作;⑥穿梭载体:真核细胞常用载体,含有在大肠杆菌的宿主细胞中进行复制与筛选的序列;⑦土壤农杆菌Ti质粒:应用于植物细胞的转化,可携带多达200kb序列;⑧杆状病毒,用于在昆虫细胞中培养表达动物蛋白;⑨哺乳动物病毒载体,该病毒可感染多种哺乳动物,如反转录病毒有强启动子,可用作基因治疗载体等。
【答案解析】