【正确答案】碱法全称为碱裂解法，是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。该方法基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的，其基本原理是碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，而是缠结成网状物质，可通过离心除去。碱法提取质粒用到的溶液及其成分、作用、操作注意事项如下： (1)溶液Ⅰ ①主要成分 50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、10mmol/L EDTA(pH 8.0)。 ②各成分的主要作用 a.葡萄糖：能使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管底。 b.Tris-HCl溶液：控制溶液的pH。 c.EDTA：Ca2+和Mg2+等金属离子的螯合剂，主要作用是抑制DNase的活性和抑制微生物生长。 ③操作中的注意事项 菌体要均匀悬浮，不能有结块，否则会降低抽提得率。 (2)溶液Ⅱ ①主要成分 0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)、1%SDS。 ②各成分的主要作用 a.NaOH：用于溶解大肠杆菌细胞。 b.SDS：一种阴离子表面活性剂，处理细胞后会导致细菌细胞壁裂解，从而使内容物释放出来，释放出来的蛋白质、质粒DNA和基因组DNA，遇到强碱变性，为下一步做铺垫。 ③操作中的注意事项 a.溶液Ⅱ要现用现配，因为裂解细菌的主要是NaOH，使用新鲜配制的NaOH是为了保证该溶液没有吸收空气中的CO2而使其碱性下降。 b.加入溶液Ⅱ的时间不能过长，而且操作要温和，不能激烈振荡，否则基因组DNA会断裂。 (3)溶液Ⅲ ①主要成分 pH 4.8的乙酸钾溶液(5mol/L乙酸钾60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL)，所配成的溶液钾离子浓度是3mol/L，乙酸根浓度是5mol/L。 ②各成分的主要作用 a.乙酸：可以中和NaOH，因为长时间的碱性环境会打断DNA。 b.乙酸钾：钾离子置换SDS中的钠离子，能形成不溶性的十二烷基硫酸钾(PDS)。由于SDS易与蛋白质结合，因此大量蛋白质被沉淀，同时分子较大的基因组DNA也易被SDS共沉淀。 ③操作中的注意事项 加入溶液Ⅲ后要冰上放置，因为在高浓度盐和低温条件下，PDS沉淀更完全。 (4)酚/氯仿/异戊醇溶液 ①主要作用 a.酚：沉淀残留的部分蛋白质，因为酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿。 b.氯仿：可使蛋白变性，增加相对密度，方便水相回收。 c.异戊醇：让离心后的分层界面更加清晰，方便水相回收；消除抽提过程中出现的泡沫。 ②操作中的注意事项 a.酚/氯仿/异戊醇体积比为25:24:1。 b.酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。 (5)无水乙醇和70%乙醇溶液 ①主要作用 a.回收后的水相含有足够多的盐，加入2倍体积的乙醇，在室温放置离心即可得到质粒DNA的沉淀。 b.如果在-20℃环境中放置的时间较长，则可能会导致大量盐的沉淀，70%乙醇可去除盐类。 ②注意事项 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。 (6)pH 8.0 TE缓冲液 ①主要成分 10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，其中含RNA酶20μg/mL。 ②主要作用 a.Tris-HCl：避免金属离子的干扰作用，DNA在pH 8.0下比较稳定。 b.EDTA：稳定DNA的活性。 c.RNA酶：降解RNA。