【正确答案】正确答案：以下是五种常用的蛋白质分离纯化技术。 (1)根据分子大小不同的纯化方法。 1)透析：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。 超过滤：是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。 2)密度梯度(区带)离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定于它的大小，也决定于它的密度，如果蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量、密度大的颗粒比质量、密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时即停滞不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成各自独立的区带。 3)凝胶过滤：当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构，即被排阻在凝胶珠之外。随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外；比网孔径小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。 (2)利用溶解度差别的纯化方法。 1)等电点沉淀：蛋白质是带正电荷和负电荷基团的两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量则因pH不同而变化。蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，其溶解度达到最低点，不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。 2)盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐(以(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 为最佳)，使水活度降低，原来溶液中的大部分甚至是全部的水转变成盐离子的水化水，从而使蛋白质水化层被破坏，疏水表面暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 3)有机溶剂分级分离法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)，引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数，而增加带电质点的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。 (3)根据电荷不同的纯化方法 1)电泳：根据蛋白质在一定的PH溶液中所带电荷，成为带电颗粒，在电场中向相反的电极方向泳动，进行蛋白质的分离。由于蛋白质的质量和电荷量不同，其在电场中的泳动率也不同，从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。 2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)／圆盘电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，有3种物理效应：样品的浓度效应；凝胶对被分离分子的筛选效应(颗粒小的移动快，颗粒大的移动慢)；一般电泳分离的电荷效应。 3)毛细管电泳：能用于分离多种生物分子，包括氨基酸、多肽、蛋白质、DNA片段和核酸以及多种小分子，如药物，甚至金属离子。 等电聚集电泳：在外电场作用下，各种蛋白质将移向并聚集(停留)于等于其等电点的pH梯度处，形成一个很窄的区带。 4)层析聚焦电泳：根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法，其原理是：当用特种多缓冲液滴洗填充在柱中的特种多缓冲液交换剂时，就会在层析柱中自上而下自动地建立起连续的pH梯度，同时加在柱上端的蛋白质样品也随多缓冲液的展开按各自的等电点聚焦在相应的pH区段，并在展开过程中随pH梯度下移，蛋白质混合物的各组分先后从柱中流出，达到分离纯化的目的。 5)离子交换层析：蛋白质是两性电解质，在一定的pH溶液中可解离成带电荷的胶体颗粒，可与柱内离子交换脂颗粒表面的相反电荷相吸引，然后用盐溶液洗脱，带电量小的蛋白质先被洗脱，随着盐浓度的增加，带电量多的也被洗脱，分部收集洗脱的蛋白质溶液，达到分离蛋白质的目的。 (4)利用选择性吸附的纯化方法(吸附层析)。 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力及解吸性质不同而达到分离目的的方法，典型的吸附剂有胶、氧化铝、活性炭等。 1)羧基磷灰石层析：用于分离蛋白质或核酸。蛋白质中带负电基团与羧基磷灰石晶体表面的Ca2’结合，正电基团与PO ₄ ^2- 相互作用。最重要的用途是把单链DNA和双链DNA分开(亲和力大小：双链DNA＞单链DNA) 2)疏水作用层析：根据蛋白质表面的疏水性差别而发展起来的纯化技术。在疏水作用层析中，不是暴露的疏水基因促进蛋白质与蛋白质之间的相互作用，而是连接在支持介质(如琼脂糖)上的疏水基因与蛋白质表面上暴露的疏水基因结合。 (5)利用配体的特异生物亲和力的纯化方法。 亲和层析利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术。将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。包括凝集素亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合层析、染料配体层析、共价层析等。实验室常用的亲和层析比如GST亲和层析和His-Ni亲和层析。