问答题
说明溴化乙锭-氯化铯密度梯度离心(ethidim bromide-caesium chloride gradient cen-trifugation)纯化DNA的原理。
【正确答案】它的基本原理有以下三点:
(1)氯化铯是一种高分子质量的重金属,在一定的高速离心场中,可以自动形成氯化铯的密度梯度。
(2)当进行离心时,CsCl溶液中的大分子物质将根据它本身的密度停留在不同的CsCl密度区,形成一个致密带,而不会像CsCl一样形成浓度梯度。CsCl溶液中大分子到底在何处形成带,将取决于大分子本身的浮力密度(buoyant density)。DNA的浮力密度大约为1.7g/cm3,离心时将迁移到CsCl的密度为1.7g/cm3处。与此相反,蛋白质的浮力密度相当低,将漂浮在离心管的顶部。而RNA则沉淀于离心管的底部。
(3)在有溴化乙锭(EB)存在的密度梯度离心中,能够将超螺旋的DNA与非超螺旋的DNA分离开来。溴化乙锭可嵌入到DNA的双螺旋分子中,使DNA部分解旋,其结果可使线性DNA的浮力密度减少0.125g/cm3。由于超螺旋的DNA没有游离的末端,解螺旋的幅度有限,也就只能结合有限的EB。因此,超螺旋DNA的浮力密度只有少许下降,大约为0.085g/cm3。结果,超螺旋的DNA将与线性、开环的DNA在EB-CsCl密度梯度离心中由于密度不同而分开。
【答案解析】