核糖体上进行多肽链延伸的四个步骤主要包括氨酰-tRNA进入核糖体A位点的选择、肽键的形成、转位和脱氨酰-tRNA的释放。具体如下：

（1）氨酰-tRNA进入核糖体A位点的选择

起始的tRNA-Met占据P位点，核糖体接受第二个氨酰-tRNA进入A位点，这就是肽链延伸的第一步。为了有效地结合A位点，第二个氨酰-tRNA必须与有GTP的延伸因子EF-Tu结合形成复合物氨酰-tRNA＇EF-Tu·GTP。只有其反密码子能与A位点的mRNA密码子匹配的氨酰-tRNA才能被核糖体牢牢捕捉并定位在A位点，从而保证正确识别tRNA。到位后，结合在EF-Tu上的GTP水解，EF-Tu连同结合在一起的GDP离开核糖体，被另一个因子EF-TS介导生成EF-Tu·GTP。

（2）肽键的形成

当核糖体的P位点与A位点都有tRNA时，通过肽键的生成将两个氨基酸结合起来。A位点氨酰-tRNA氨基酸的氨基与P位点tRNA上氨基酸的羧基形成肽键。这一反应由肽酰转移酶催化，该酶是核糖体大亚基rRNA，活性位点位于23SrRNA结构域V的中央环。

（3）转位

转位，即核糖体沿着mRNA分子的5＇-3＇方向移动3个核苷酸（一个密码子）。在转位过程中，携带二肽的tRNA从A位点移位到P位点，而没有携带任何氨基酸的tRNA从P位点移位到E位点。原核细胞GTP结合的延伸因子EF-G能促进移位过程的发生（真核生物是延伸因子EF-2）。

（4）脱氨酰-tRNA的释放

延伸反应的最后一步是脱氨酰-tRNA离开核糖体E位点。一旦肽酰-tRNA通过转位从A位点移位到P位点后，A位点再次接受下一个能与mRNA第三个密码子匹配的氨酰-tRNA，又开始新的肽链延伸循环。