问答题 (1)简述分子筛层析的基本原理。
(2)用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时,样品孔应放在电泳槽的哪一极?为什么?
(3)电泳是分离生物大分子的主要方法之一,简述其原理。
(4)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以测定蛋白质的相对分子质量,其原理是什么?相对分子质量不同的蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率与其相对分子质量有什么关系?
(5)简述SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理,你使用该技术分离和检测过何种物质?主要操作步骤有哪些?
【正确答案】
【答案解析】电泳是指溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。在确定的条件下,带电粒子在单位电场强度作用下,单位时间内移动的距离(即迁移率)为常数,是该带电粒子的物化特征性常数。不同带电粒子因所带电荷不同,或虽然所带电荷相同但荷质比不同,在同一电场中电泳,经一定时间后,由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。
利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。蛋白质颗粒在各种介质中的电泳迁移率取决于自身所带的净电荷及分子大小和形状等因素。按分离原理的不同,电泳分为4类:移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)和少量的巯基乙醇,加入SDS后,每克蛋白质可结合1.4gSDS,不但将不同种类蛋白质的原有电荷掩盖,而且改变了蛋白质单体分子的构象,使多肽链覆盖上相同密度的负电荷,而且使分子变成棒状。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时,蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子质量,而与原来所带电荷和分子形状无关。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以测定分子质量,由于凝胶的分子筛效应,不同蛋白质相对迁移率与其分子质量的对数呈线性关系。用已知分子质量的标准蛋白作标准曲线,即可求出未知蛋白的分子质量。