酿酒酵母孢子固定化聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶的酶学性质研究

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作者 白佳文 王亚森 +4 位作者 杜祥坤 佀辰钰 兰周格 中西秀树 李子杰 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第5期78-84,共7页

基于酿酒酵母孢子表面展示系统,实现聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)水解酶FAST-PETase的孢子固定化。使用整合型质粒pRS306-TEF1pr-ss-FAST-PETase,将编码FAST-PETase的基因插入到酿酒酵母dit1Δ缺陷型菌株的基... 基于酿酒酵母孢子表面展示系统,实现聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)水解酶FAST-PETase的孢子固定化。使用整合型质粒pRS306-TEF1pr-ss-FAST-PETase,将编码FAST-PETase的基因插入到酿酒酵母dit1Δ缺陷型菌株的基因组中,使蛋白更加稳定的表达。以双-2-(羟乙基)对苯二甲酸酯[bis(2-hydroxyethyl)terephthalate,BHET]为底物,对孢子固定化FAST-PETase的最适反应条件、热稳定性、pH耐受性、洗涤剂/有机试剂耐受性和重复使用能力进行研究。孢子固定化FAST-PETase的最适反应条件为50℃,pH 8.0。在30~80℃孵育12 h后,能保留82%以上的活性。同样地,在pH 5.0~9.0孵育12 h后,也能保持78%以上的活性。与游离酶相比,孢子固定化FAST-PETase对有机试剂也有一定的抗性,在重复使用7次后仍然保留初始活性的35%。该研究利用酿酒酵母孢子表面展示系统成功实现孢子固定化FAST-PETase,并将其应用于BHET的水解中,为PET塑料的长期降解提供了新的平台。 展开更多

关键词 酿酒酵母 孢子表面展示 FAST-PETase BHET降解 酶学性质

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3-磷酸甘油醛对酵母孢子萌发的抑制作用分析

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作者 成卓 刘国玉 中西秀树 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期42-48,共7页

在酿酒酵母孢子中,存在糖酵解产物3-磷酸甘油醛(3-glyceraldehyde phosphate,GAP)参与的抑制萌发的负调节机制,但是目前的调控途径并不完善。该研究目的是发现GAP对萌发孢子的影响,并深入了解其负调控机制。重点分析以GAP为底物的糖酵... 在酿酒酵母孢子中,存在糖酵解产物3-磷酸甘油醛(3-glyceraldehyde phosphate,GAP)参与的抑制萌发的负调节机制,但是目前的调控途径并不完善。该研究目的是发现GAP对萌发孢子的影响,并深入了解其负调控机制。重点分析以GAP为底物的糖酵解酶——三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)在调控机制中的作用。该文采用富营养培养基和热处理等多种条件诱导酵母孢子萌发,并通过荧光增白剂染色来测定萌发率。分别在有无GAP的条件下诱导萌发,研究GAPDH的表达水平。接着利用qPCR的方法检验GAPDH mRNA的表达水平。此外,在酵母中敲除TDH1、TDH2和TDH3这3个GAPDH的结构基因,分析突变体的萌发效率。结果显示当营养物诱导或加热处理促使孢子萌发时,GAPDH的表达水平显著降低,而在孢子萌发的过程中添加GAP反而会增加GAPDH水平。qPCR结果显示孢子萌发时GAPDH的mRNA水平没有降低,故GAPDH表达水平的降低是因为在萌发过程中蛋白被降解。且GAPDH单个结构基因的缺失会增加孢子的萌发率。结果表明GAPDH参与GAP介导的负调控机制。 展开更多

关键词 静止期细胞 酵母 三磷酸甘油醛脱氢酶 孢子 萌发

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福氏志贺菌来源L-鼠李树胶糖激酶的克隆表达及酶学性质分析

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作者 冯林雪 陈洲 +5 位作者 王亚森 冯康 许向阳 李子杰 中西秀树 高晓冬 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2021年第20期1-7,共7页

D-阿洛酮糖是一种具有保健功能的稀有糖,目前其生产主要利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)将D-果糖转化为D-阿洛酮糖,但该反应转化率低,仅能达到30%左右。基于L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)的“磷酸... D-阿洛酮糖是一种具有保健功能的稀有糖,目前其生产主要利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)将D-果糖转化为D-阿洛酮糖,但该反应转化率低,仅能达到30%左右。基于L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)的“磷酸化-脱磷酸”级联反应可提高反应转化率,然而目前有关RhaB的研究较少。该文研究了一种新型来源福氏志贺菌(Shigella flexneri 2a str.301)来源的RhaB,从福氏志贺菌(S.flexneri 2a str.301)的基因组DNA中克隆得到RhaB基因,将其与质粒载体pET28a连接,在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达。构建突变菌株RhaB^(E437Q),将酶活性提高了10倍,且大部分包涵体蛋白变为可溶性蛋白。利用载体上组氨酸标签对重组酶分离纯化,对其酶学性质进行了一系列研究。结果表明,重组蛋白RhaB^(E437Q)为单体蛋白,分子质量为54 kDa;最适反应条件为40℃,pH 8.5,Mn^(2+);其只对C-3构型为R构型的糖有催化活性;将其与底物D-阿洛酮糖进行分子对接,对其催化机制进行了初步研究。 展开更多

关键词 L-鼠李树胶糖激酶 福氏志贺菌 克隆与表达 酶学性质 D-阿洛酮糖 催化机制

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酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示乙醛脱氢酶以及检测乙醛的应用

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作者 杜祥坤 费康清 +3 位作者 王亚森 白佳文 中西秀树 李子杰 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第22期318-326,共9页

乙醛是对人体有毒的化合物,乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)能将乙醛氧化为无毒的乙酸,同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H。目前检测乙醛的方法繁琐且耗时费力,该研究采用酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示热带假丝酵母(Candida tr... 乙醛是对人体有毒的化合物,乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase,ALDH)能将乙醛氧化为无毒的乙酸,同时将NAD(P)+转化为NAD(P)H。目前检测乙醛的方法繁琐且耗时费力,该研究采用酿酒酵母孢子“微胶囊”表面展示热带假丝酵母(Candida tropicalis)LBBE-W1来源的乙醛脱氢酶,建立一种新颖快速检测乙醛的方法。首先,基于蛋白质免疫印迹与荧光结果证实ALDH能够在孢子中表达且定位在孢子壁上。然后,测定了孢子表面展示ALDH与游离ALDH的酶学性质。结果显示,孢子表面展示ALDH和游离酶的最适温度与pH值分别为40℃和9.0;与游离酶相比,孢子表面展示ALDH具有更高的活性,以及更佳的温度与pH稳定性。此外,孢子表面展示ALDH对十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、蛋白酶K具有更强的耐受性;孢子表面展示ALDH与游离乙醛脱氢酶的最适底物都是乙醛,并且孢子表面展示ALDH具有良好的重复使用性能。最后,将孢子表面展示ALDH作为生物传感器检测乙醛,结果表明在0~500μmol/L的乙醛浓度范围内具有良好的线性关系,其R2值为0.9992。该研究成功构建一种新颖的生物传感器,为乙醛的检测提供一种新的方法。 展开更多

关键词 孢子表面展示 乙醛脱氢酶 生物传感器 酿酒酵母 乙醛检测

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组蛋白激活晚期糖基化终末产物受体并引发炎症反应

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作者 孙常津 杨岩 +1 位作者 刘国玉 中西秀树 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期78-84,共7页

晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)是免疫球蛋白受体,能够与多种配体结合,研究发现RAGE参与了非专职吞噬细胞对组蛋白修饰的微米颗粒的吞噬过程,但目前没有研究证明组蛋白是RAGE的配体。该研... 晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)是免疫球蛋白受体,能够与多种配体结合,研究发现RAGE参与了非专职吞噬细胞对组蛋白修饰的微米颗粒的吞噬过程,但目前没有研究证明组蛋白是RAGE的配体。该研究对组蛋白分子能否直接激活RAGE及其下游信号通路进行探究。使用共聚焦显微镜和流式细胞仪检测哺乳动物细胞对可溶性组蛋白分子的内化;采用钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶染色法检测细胞活性;通过荧光探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯检测胞内活性氧水平;利用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定炎症因子的释放。结果表明,组蛋白分子能够被野生型HEK293T细胞内化并于胞内溶酶体中聚集,RAGE-敲除细胞则无法内化组蛋白;培养基组蛋白质量浓度在100μg/mL时对细胞无明显毒性,细胞活性正常;组蛋白能够通过RAGE刺激细胞活性氧水平升高,并释放炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6);组蛋白与DNA结合能够增强对RAGE的刺激。以上结果表明,组蛋白能够激活RAGE及其下游炎症通路。 展开更多

关键词 晚期糖基化终末产物受体 组蛋白 胞饮 活性氧 炎症

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基于RhaD醛缩酶的“一锅四酶法”合成D-山梨糖和D-阿洛酮糖 被引量：2

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作者 高雅慧 金则成 +3 位作者 钱超 李子杰 中西秀树 高晓冬 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第21期210-214,共5页

利用L-1-磷酸鼠李树胶糖醛缩酶(RhaD)以较低成本同时合成稀有糖D-山梨糖和D-阿洛酮糖。为避免直接使用价格昂贵且不稳定的底物磷酸二羟基丙酮(DHAP),以便宜的底物DL-3-磷酸甘油作为前体,采用基于RhaD和磷酸酶(AP或YqaB)的"一锅四酶... 利用L-1-磷酸鼠李树胶糖醛缩酶(RhaD)以较低成本同时合成稀有糖D-山梨糖和D-阿洛酮糖。为避免直接使用价格昂贵且不稳定的底物磷酸二羟基丙酮(DHAP),以便宜的底物DL-3-磷酸甘油作为前体,采用基于RhaD和磷酸酶(AP或YqaB)的"一锅四酶法"对D-山梨糖和D-阿洛酮糖的合成进行了优化。产物D-山梨糖和D-阿洛酮糖用TLC、HPLC进行检测,并分别采用硅胶、P-2凝胶、Ca2+离子交换树脂对产物进行纯化以及1H NMR对产物进行鉴定。结果表明"一锅四酶法"以及分离纯化方法可高效地应用于D-山梨糖和D-阿洛酮糖的实际生产。该方法的建立将为其他稀有糖及其衍生物的合成提供理论依据。 展开更多

关键词 RhaD 醛缩酶 一锅四酶法 磷酸二羟基丙酮 稀有糖

原文传递

基于酵母产孢的syntaxin家族蛋白SNARE区域功能分析 被引量：3

7

作者 王丽萍 邵侃凯 +1 位作者 高晓冬 中西秀树 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期530-535,共6页

真核细胞中大部分膜融合过程由SNARE蛋白介导,但其功能和调节机制尚未完全清楚。酵母孢子形成是研究囊泡融合机制包括SNARE蛋白的理想模型系统。在该过程中涉及t-SNARE蛋白Sso1,它是突触囊泡融合所需蛋白syntaxin 1A的同源物,两者SNARE... 真核细胞中大部分膜融合过程由SNARE蛋白介导,但其功能和调节机制尚未完全清楚。酵母孢子形成是研究囊泡融合机制包括SNARE蛋白的理想模型系统。在该过程中涉及t-SNARE蛋白Sso1,它是突触囊泡融合所需蛋白syntaxin 1A的同源物,两者SNARE区域有51%的同源性。尽管如此,将SSO1的SNARE区域完全替换成syntaxin 1A,而构建的嵌合体却无法回补sso1△突变的产孢缺陷。为了确定哪些残基为Sso1功能所必须,作者进行了嵌合体和突变分析,发现Sso1/syntaxin 1A嵌合体中syntaxin 1A的SNARE区域的220位丙氨酸换成谷氨酸后获得产孢功能。另外,Sso1发生相应的突变-218位谷氨酸突变成丙氨酸后失去其功能。因此,218位谷氨酸残基为Sso1产孢功能所必须。 展开更多

关键词 SNARE 人源化 酿酒酵母 Sso1p syntaxin1A

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固定化酶新技术——酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶技术 被引量：3

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作者 孔军 李子杰 +1 位作者 中西秀树 高晓冬 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期257-265,共9页

随着固定化酶技术的日新月异,微胶囊技术得到了长足的发展。与传统微胶囊生产技术不同,文章介绍了一种"天然的"微胶囊固定化酶生产新技术——酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶技术,详述了该固定化技术原理及实例。该技术优点在于:... 随着固定化酶技术的日新月异,微胶囊技术得到了长足的发展。与传统微胶囊生产技术不同,文章介绍了一种"天然的"微胶囊固定化酶生产新技术——酿酒酵母孢子微胶囊固定化酶技术,详述了该固定化技术原理及实例。该技术优点在于:固定化酶的组装"自然"完成,具有天然抗逆性,大小均一,可重复使用,绿色环保,可实现多种酶的共同固定。最后,对其应用前景进行了展望。 展开更多

关键词 固定化酶 微胶囊技术 酿酒酵母孢子固定化酶 “一孢多酶”法

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木糖异构酶酿酒酵母孢子“微胶囊”的构建及酶学性质分析 被引量：2

9

作者 李毅 李子杰 +1 位作者 中西秀树 高晓冬 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期6-11,共6页

将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的木糖异构酶(XI)基因xyl A与SPR1信号肽序列(ss)融合后连接到p RS424-TEFpr表达载体上,将重组质粒p RS424-TEFpr-ss-xyl A转化酿酒酵母AN120野生型菌株、osw2Δ缺陷型菌株以及dit1Δ缺陷型菌... 将来源于嗜热细菌Thermus thermophilus HB8的木糖异构酶(XI)基因xyl A与SPR1信号肽序列(ss)融合后连接到p RS424-TEFpr表达载体上,将重组质粒p RS424-TEFpr-ss-xyl A转化酿酒酵母AN120野生型菌株、osw2Δ缺陷型菌株以及dit1Δ缺陷型菌株并进行产孢。通过荧光定位、蛋白免疫印迹分析以及酶活测定,表明酿酒酵母孢子"微胶囊"固定化酶系统构建成功。由于该固定化酶的最佳反应温度为85℃,避免了酿酒酵母孢子在D-葡萄糖为底物条件下萌发的弊端。同时,根据蛋白免疫印迹分析和重复利用性结果,表明二酪氨酸层的存在对于酶的包埋,对高温的耐受性都表现出了较好的特性。此外对野生型和osw2Δ孢子固定的XI的酶学性质进行了研究,相对于游离酶,孢子固定化酶更加稳定。在p H为6的酸性条件或p H为9的碱性条件下,固定化酶相对酶活能达到60%以上,同时在温度95℃时,固定化的酶相对酶活也能达到60%以上。与野生型孢子相比,osw2Δ孢子展现出了潜在的优势,既可以有效阻止酶的释放,又提高了底物分子的通透性。 展开更多

关键词 酿酒酵母 孢子 木糖异构酶 酶固定化

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人体线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶在酿酒酵母中的表达 被引量：3

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作者 韩宝仙 高晓冬 中西秀树 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期987-992,共6页

O-GlcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的动态可逆的蛋白质翻译后修饰方式,广泛分布在细胞浆和细胞核中,参与调节多种细胞途径。蛋白质的O-GlcNAc糖基化与许多疾病密切相关,如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。在体内,O-GlcNA... O-GlcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的动态可逆的蛋白质翻译后修饰方式,广泛分布在细胞浆和细胞核中,参与调节多种细胞途径。蛋白质的O-GlcNAc糖基化与许多疾病密切相关,如糖尿病、神经退行性疾病和癌症等。在体内,O-GlcNAc动态修饰由N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)和N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)协同完成。OGT具有3种异构体,分别是ncOGT、mOGT和sOGT。目前对于mOGT的功能和调节机制尚未清楚。作者在酿酒酵母细胞中表达了人源的mOGT,发现mOGT抑制酵母细胞的生长。在酿酒酵母细胞中mOGT具有O-GlcNAc糖基化活性,当其活性位点突变后,O-GlcNAc糖基化活性明显降低,但其同样能抑制酵母细胞生长。作者在酿酒酵母细胞中构建了研究mOGT的系统。可以利用该人源化的酵母筛选和mOGT相互作用的蛋白质和基因,也可以用来筛选抑制mOGT活性的药物,进而研究mOGT的功能与调节机制。 展开更多

关键词 O-GlcNAc糖基化 人源化 酿酒酵母 线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(mOGT)

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酿酒酵母孢子表面展示系统的构建及应用 被引量：1

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作者 乔颍鑫 李子杰 +1 位作者 中西秀树 高晓冬 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期8-14,共7页

旨在建立1种酿酒酵母孢子表面展示系统,并将其应用于稀有糖合成。表面展示系统是运用微生物自身功能把外源蛋白或多肽展示在细胞表面,文中用磷酸甘油氧化酶(GPO)来验证酿酒酵母孢子表面展示系统的可行性。将编码肺炎链球菌来源的GPO的基... 旨在建立1种酿酒酵母孢子表面展示系统,并将其应用于稀有糖合成。表面展示系统是运用微生物自身功能把外源蛋白或多肽展示在细胞表面,文中用磷酸甘油氧化酶(GPO)来验证酿酒酵母孢子表面展示系统的可行性。将编码肺炎链球菌来源的GPO的基因glpo与信号肽序列(ss)融合后连接到载体p RS424-TEFpr上,将重组质粒p RS424-TEFpr-ss-glpo转化至酿酒酵母野生型及缺陷型菌株中并进行产孢,通过荧光观察、western blot分析以及酶活测定,表明酿酒酵母缺陷型孢子可以实现蛋白的表面展示。通过对GPO孢子表征,表明GPO孢子在pH为7.0、温度为30℃时活性最高,该孢子作为催化剂可以重复使用,当使用第3次时,活性可达最大活性的40%。最后将GPO孢子应用于"一锅四酶法"进行稀有糖L-果糖的合成,转化率为12%。 展开更多

关键词 孢子表面展示 磷酸甘油氧化酶 酿酒酵母 稀有糖

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表达人源HPD基因对酿酒酵母孢子壁二酪氨酸层正确组装的干扰 被引量：1

12

作者 王晓文 殷政 +1 位作者 高晓冬 中西秀树 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第15期17-23,共7页

研究人类基因4-羟苯丙酮酸二加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)的表达对酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae )产孢过程及酵母孢子壁组装的影响。将 HPD 导入酿酒酵母中,比较人源化 HPD 酵母与野生型酵母的表型差异,分析... 研究人类基因4-羟苯丙酮酸二加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)的表达对酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae )产孢过程及酵母孢子壁组装的影响。将 HPD 导入酿酒酵母中,比较人源化 HPD 酵母与野生型酵母的表型差异,分析 HPD 对酵母产孢及孢子壁的影响。与野生型酵母相比,人源化 HPD 酵母对产孢率无影响,但孢子自身荧光强度下降,乙醚敏感性增加,荧光增白剂(calcofluor white,CFW)染色荧光强度增强,该结果表明孢子壁出现缺陷,其二酪氨酸层组装过程中部分缺失。进一步研究发现,人源化 HPD 酵母产孢时,Hpd蛋白的催化产物尿黑酸(homogentisate,HGA)在产孢过程中会被氧化从而引起培养基颜色变化,且二酪氨酸复合物会大量泄漏至培养基中,最终导致二酪氨酸层不能正确组装。该研究结果为酿酒酵母二酪氨酸层的形成机制提供了新的认知。 展开更多

关键词 酿酒酵母 4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPD) 产孢子 二酪氨酸层 氧化性 组装

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酿酒酵母孢子作为GLP-1载体的研究 被引量：1

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作者 黄丹娣 张慧杰 +3 位作者 闫听 冯诗倪 中西秀树 高晓冬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期39-45,共7页

胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)的口服给药研究已成为目前抗糖尿病研究领域的热点之一。本文通过对GLP-1进行基因改造和优化,并以酿酒酵母孢子作为保护和运输载体,将GLP-1表达到酿酒酵母孢子内,使GLP-1能在口服给药... 胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)的口服给药研究已成为目前抗糖尿病研究领域的热点之一。本文通过对GLP-1进行基因改造和优化,并以酿酒酵母孢子作为保护和运输载体,将GLP-1表达到酿酒酵母孢子内,使GLP-1能在口服给药过程中抵抗胃肠道消化酶的降解以提高其生理活性。结果表明,GLP-1被成功表达到酿酒酵母孢子内,表达GLP-1的孢子经模拟肠胃液处理后与胰岛β细胞MIN6细胞共培养可显著提高MIN6细胞胰岛素分泌量。本研究利用酿酒酵母孢子作为载体,提高了GLP-1的抗酶解能力和促胰岛素活性,为进一步开发治疗糖尿病口服药物奠定了基础。 展开更多

关键词 糖尿病 胰高血糖素样肽-1 酿酒酵母 孢子 胰岛素

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毕赤酵母含硫氨基酸生物合成途径

14

作者 张平平 喜多岛敏彦 +2 位作者 王宁 高晓冬 中西秀树 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第7期58-64,共7页

含硫氨基酸是所有生物生长繁殖不可缺少的氨基酸。尽管毕赤酵母在工业发酵中作为重要的表达菌株,但是其含硫氨基酸的生物合成途径尚未明了。作者采用生物信息学及表型分析的方法,阐明了毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径。结果表明,毕... 含硫氨基酸是所有生物生长繁殖不可缺少的氨基酸。尽管毕赤酵母在工业发酵中作为重要的表达菌株,但是其含硫氨基酸的生物合成途径尚未明了。作者采用生物信息学及表型分析的方法,阐明了毕赤酵母含硫氨基酸的生物合成途径。结果表明,毕赤酵母可通过O-乙酰同丝氨酸及O-乙酰丝氨酸与无机硫元素合成含硫氨基酸,甲硫氨酸与半胱氨酸也可通过转硫途径实现相互转化。另外毕赤酵母cys3Δ突变菌株在未添加半胱氨酸的合成培养基中对硒代甲硫氨酸表现出显著的抗性。综上所述,未来有望应用毕赤酵母表达硒蛋白用于蛋白质三级结构的分析。 展开更多

关键词 毕赤酵母 O-乙酰同丝氨酸 O-乙酰丝氨酸 转硫途径 硒代甲硫氨酸

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筛选特异性抑制酿酒酵母产孢的人类基因

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作者 殷政 中西秀树 +3 位作者 李子杰 张慧杰 藤田盛久 高晓冬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期85-92,共8页

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)二倍体细胞在缺乏氮源且存在非发酵型碳源时,营养细胞停止生长,进入产孢过程并通过减数分裂形成单倍体孢子。产孢过程并不存在于哺乳动物细胞中,但该过程中发生的很多细胞活动在真核细胞中存在保守... 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)二倍体细胞在缺乏氮源且存在非发酵型碳源时,营养细胞停止生长,进入产孢过程并通过减数分裂形成单倍体孢子。产孢过程并不存在于哺乳动物细胞中,但该过程中发生的很多细胞活动在真核细胞中存在保守性。作者建立了一个筛选特异性抑制酿酒酵母产孢的人类基因的方法。在酿酒酵母中表达单独的人类基因,筛选得到抑制产孢过程但对酿酒酵母营养细胞生长不产生影响的候选人类基因。获得的候选基因很大可能涉及营养敏感性、减数分裂以及膜运输重组这些产孢过程中发生的细胞活动。本研究对新功能人类基因的发现以及将酿酒酵母作为遗传研究工具有着重要的意义。 展开更多

关键词 酿酒酵母 筛选 人类基因 抑制产孢 减数分裂

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甘油激酶的表达纯化及在酮糖合成中的应用

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作者 吴晓茹 李子杰 +1 位作者 中西秀树 高晓冬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期817-823,共7页

研究了大肠杆菌MG1655来源的甘油激酶(GK)的表达及其在酮糖合成中的应用。本研究从大肠杆菌MG1655扩增了甘油激酶的基因片段glpK,连接到表达载体pET-28a上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,利用Ni^(2+)亲和层析柱纯化目的蛋... 研究了大肠杆菌MG1655来源的甘油激酶(GK)的表达及其在酮糖合成中的应用。本研究从大肠杆菌MG1655扩增了甘油激酶的基因片段glpK,连接到表达载体pET-28a上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,利用Ni^(2+)亲和层析柱纯化目的蛋白。利用该甘油激酶可以催化成本较低的底物甘油生成L-3-磷酸甘油,再经过磷酸甘油氧化酶(GPO)的催化生成磷酸二羟基丙酮(DHAP),生成的DHAP可以在不同的DHAP依赖性醛缩酶的催化下与受体D-甘油醛合成酮糖-1-磷酸,最终用酸性磷酸酶脱掉磷酸生成一系列酮糖。结果表明,该酶成功地用于"一釜多酶法"合成体系中,以便宜的底物甘油为前体,合成出包括稀有糖在内的一系列酮糖,生成的产物、产率及比例用TLC、HPLC进行检测。该方法的建立将为其他稀有糖及其衍生物的合成提供理论依据。 展开更多

关键词 甘油激酶 醛缩酶 磷酸二羟基丙酮 一釜多酶法 酮糖

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布氏锥虫来源内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和活性鉴定

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作者 崔娟 喜多岛敏彦 +2 位作者 王宁 中西秀树 高晓冬 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期8-13,共6页

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外... 内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外还具有转糖基活性,能够以切除后再将均一的寡糖链转移到N-糖蛋白的β-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)上的方式,改造医药糖蛋白的N-糖基化修饰。通过数据库检索,在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的基因组中找到了GH85家族ENGase的同源序列,并命名为Endo-Tb基因,对其克隆后在带有Nus融合蛋白的原核(E.coli)表达载体上成功表达并纯化。检测到融合蛋白Nus-Endo Tb能够水解高甘露糖型和双天线的复合型糖链,但不能作用于三天线的复合型糖链。同时Nus-Endo Tb可以水解核糖核酸酶B和人类转铁蛋白上的N糖链。当用唾液酸糖肽(SGP)作为糖基供体,MU-GlcNAc作为糖基受体时,通过荧光基质底物四甲基伞形酮(MU)检测到Nus-Endo Tb具有转糖基活性。 展开更多

关键词 内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶 转糖基作用 布氏锥虫 Nus-Endo Tb

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酿酒酵母糖基化缺陷型菌株中ALG6基因的过量表达

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作者 张阁元 徐沙 +1 位作者 高晓冬 中西秀树 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期1-7,共7页

利用酿酒酵母生产人源化糖蛋白,需对其糖基化途径进行基因工程改造。酿酒酵母糖基化相关基因ALG3、OCH1、MNN1的敲除导致胞内糖蛋白低的N-聚糖位点占有率和菌株缓慢的生长速度。为了提高糖基化缺陷型菌株的N-聚糖位点占有率,酿酒酵母的A... 利用酿酒酵母生产人源化糖蛋白,需对其糖基化途径进行基因工程改造。酿酒酵母糖基化相关基因ALG3、OCH1、MNN1的敲除导致胞内糖蛋白低的N-聚糖位点占有率和菌株缓慢的生长速度。为了提高糖基化缺陷型菌株的N-聚糖位点占有率,酿酒酵母的ALG6基因被过量表达。结果表明,ALG6的过量表达不仅能够提高菌株N-聚糖位点占有率,还能回补其生长速度,提高外源蛋白人类溶菌酶的分泌效果。 展开更多

关键词 酿酒酵母 人源化 糖蛋白 N-聚糖位点占有率

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osw2对酿酒酵母孢子固定化酶影响的分析

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作者 赵强 李子杰 +1 位作者 中西秀树 高晓冬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期845-852,共8页

构建了α-半乳糖苷酶(Mel1p)的多拷贝质粒pRS426-TEFpr-MEL1,转入酿酒酵母野生型AN120及osw2△突变株并进行固定化酶活性测定。实验分别选取蜜二糖、棉子糖(三糖)与水苏糖(四糖)3种低聚寡糖作为Mel1p的底物,检测两种菌株孢子固定化酶对... 构建了α-半乳糖苷酶(Mel1p)的多拷贝质粒pRS426-TEFpr-MEL1,转入酿酒酵母野生型AN120及osw2△突变株并进行固定化酶活性测定。实验分别选取蜜二糖、棉子糖(三糖)与水苏糖(四糖)3种低聚寡糖作为Mel1p的底物,检测两种菌株孢子固定化酶对这3种底物的催化活性,结果表明野生型AN120酵母孢子壁的孔径最大只允许介于三糖和四糖之间的底物通过,四糖不能通过;而osw2△突变株酵母孢子壁的孔径可以允许四糖通过。通过孢子固定化酶保护性实验,发现孢子固定化酶可以完全抵抗2%SDS的处理,也可部分抵抗10%SDS的处理。通过8 mol/L尿素处理后,酶活检测发现野生型AN120酵母孢子可阻挡尿素对孢子固定化酶的影响,而osw2△孢子不能;蛋白免疫印迹分析进一步表明,尿素处理后野生型AN120酵母孢子固定化酶的含量几乎不变,而osw2△突变株孢子固定化酶的含量明显降低,说明尿素可进入osw2△突变株孢子内部溶解并降低固定化酶的含量,但对AN120酵母孢子无影响。本研究也在多种突变株孢子中表达Mel1p,并进行活性比较,发现osw2△,osw2△ydl186w△及osw2△ydr326c△突变株固定化酶均有很高的催化活性。 展开更多

关键词 酿酒酵母孢子 Α-半乳糖苷酶 固定化酶

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Ogataea minuta来源的内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和纯化

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作者 贾元苓 喜多岛敏彦 +2 位作者 李子杰 高晓冬 中西秀树 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期1313-1318,共6页

在大肠杆菌中表达有活性的Ogataea minuta来源的内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EndoOm),利用p ET系统过量表达Endo-Om。在优化宿主菌及培养条件后,镍柱纯化目的蛋白质,并检测纯化后的Endo-Om对荧光标志的寡糖链的水解活性。经IPTG诱导后,... 在大肠杆菌中表达有活性的Ogataea minuta来源的内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(EndoOm),利用p ET系统过量表达Endo-Om。在优化宿主菌及培养条件后,镍柱纯化目的蛋白质,并检测纯化后的Endo-Om对荧光标志的寡糖链的水解活性。经IPTG诱导后,目的蛋白质可以很好地表达,但大部分存在包涵体中。通过培养条件优化,16℃在Overnight ExpressTMInstant LB培养基(默克)中培养,实现了Endo-Om在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化,并检测到了纯酶的水解活性。在大肠杆菌中成功纯化了有活性的Endo-Om蛋白,为加速研究该酶的结构和功能奠定了基础。 展开更多

关键词 Endo-Om 异源表达 纯化

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