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蚀斑法分离纯化BHV-1和BPIV-3混合病毒 被引量:1
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作者 马玉梅 张海霞 +6 位作者 包晓婧 令瑛 李向茸 李琼毅 魏嘉 李倬 冯若飞 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2017年第1期37-38,42,共3页
利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并R... 利用蚀斑试验方法对牛疱疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒进行分离纯化及鉴定,为BHV-1、BPIV-3感染的诊断提供科学依据。将不同稀释度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接种至牛肾原代细胞,加营养琼脂培养,产生蚀斑后扩增并RT-PCR鉴定。将纯化后毒液分别进行二次蚀斑纯化及鉴定。结果 BHV-1和BPIV-3混合病毒第6~7 d可产生明显蚀斑。鉴定阳性的BHV-1和BPIV-3进行二次蚀斑,鉴定结果均为阳性,且分离的两种病毒TCID_(50)测定结果为10^(-8.5)/0.1 m L、10^(-6.5)/0.1 m L。首次通过蚀斑试验,成功分离并得到了两株毒力较高且纯化的BHV-1和BPIV-3病毒株。 展开更多
关键词 牛疱疹病毒1型 牛副流感病毒3型 蚀斑试验 病毒分离 病毒纯化
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重组人白细胞介素7在HEK293细胞中稳定分泌表达
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作者 李向茸 王兴陇 +5 位作者 令瑛 徐雷 李琼毅 张海霞 包晓婧 冯若飞 《生物学杂志》 CAS CSCD 2017年第5期24-28,共5页
通过构建人白细胞介素7的重组真核表达载体,转染HEK293细胞,实现IL-7在HEK293细胞中的稳定分泌表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。从质粒p LV-CMV-EF1-GP-r IL-7中扩增人IL-7全长基因,并将其构建于pc DNA3.1真核表达载体上。利用脂质体... 通过构建人白细胞介素7的重组真核表达载体,转染HEK293细胞,实现IL-7在HEK293细胞中的稳定分泌表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。从质粒p LV-CMV-EF1-GP-r IL-7中扩增人IL-7全长基因,并将其构建于pc DNA3.1真核表达载体上。利用脂质体法将重组质粒转染HEK293细胞,经G418筛选及单克隆,获得稳定分泌表达IL-7的HEK293-r IL-7细胞系。成功构建真核表达质粒pc DNA3.1-r IL-7,并实现IL-7在HEK293细胞上的稳定分泌表达,最终获得了1株表达量较高的细胞株,命名为HEK293-IL7-2G3细胞,培养48 h的细胞上清中IL-7的含量为3.2 ng/m L。为进一步实现人白细胞介素7在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定基础。 展开更多
关键词 白细胞介素7 转染 绿色荧光蛋白 分泌表达
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猪波形蛋白的原核表达及其对口蹄疫病毒浸染PK-15细胞的作用
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作者 令瑛 马雪青 +7 位作者 李平花 张婧 李坤 付元芳 冯若飞 马忠仁 卢曾军 刘在新 《动物医学进展》 北大核心 2019年第1期12-19,共8页
为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行... 为研究波形蛋白在病毒侵染过程中发挥的作用,原核表达猪波形蛋白与病毒互感后检测其复制能力。根据GenBank中已发表的波形蛋白序列,设计特异性引物,从PK-15细胞中扩增波形蛋白基因,并将其克隆至pET-28a(+)载体,转化大肠埃希菌BL21进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,进行目的蛋白的纯化及复性,并利用病毒抑制试验,检测其在病毒感染过程中的作用。结果表明,成功地克隆了猪波形蛋白基因,并克隆至pET-28a(+)载体,经诱导后高效表达,经纯化复性获得的波形蛋白抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)侵染Marc-145细胞,然而并不抑制口蹄疫(FMDV)侵染PK-15细胞。随后借助细胞流式术检测PK-15细胞中波形蛋白的分布,显示其主要存在于细胞膜内的基质中。猪源波形蛋白的克隆表达,为进一步研究猪源波形蛋白与口蹄疫病毒蛋白之间的相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪波形蛋白 原核表达 口蹄疫病毒 PK-15细胞
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rhIL-7生物信息学分析及原核系统分泌表达
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作者 令瑛 徐雷 +3 位作者 李向茸 张海霞 马忠仁 冯若飞 《西北民族大学学报(自然科学版)》 2017年第2期60-69,共10页
通过生物信息学分析并预测hIL7糖基化位点、磷酸化位点、信号肽预测、跨膜蛋白、亲疏水性,构建pGEX-4T-1-hIL-7原核表达载体,转化至大肠杆菌LB21(DE3),优化hIL-7表达条件,利用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定重组蛋白.表明hIL-7与猴的同... 通过生物信息学分析并预测hIL7糖基化位点、磷酸化位点、信号肽预测、跨膜蛋白、亲疏水性,构建pGEX-4T-1-hIL-7原核表达载体,转化至大肠杆菌LB21(DE3),优化hIL-7表达条件,利用SDS-PAGE电泳和WesternBlot鉴定重组蛋白.表明hIL-7与猴的同源性一致,是一个含有13个磷酸化位点及3个糖基化位点,具有信号肽的亲水性分泌蛋白.重组载体经DNA测序,显示包含正确的hIL-7编码序列.将pGEX-4T-1-hIL-7重组载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导表达融合蛋白(含GST标签),相对分子量约为43 000 Da,表达形式为包涵体表达.采用单因素方法对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度进行考查.在此基础上进行3因素3水平正交实验的统计学优化,得到的最优表达条件为37℃、6 h、IPTG浓度0.5 mmol/L. 展开更多
关键词 重组人白介素7 原核表达 生物信息学 条件优化 单因素法 正交实验
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白细胞介素-7基因慢病毒表达载体的构建及在CHO-K1细胞中的稳定表达 被引量:2
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作者 李向茸 令瑛 +5 位作者 徐雷 包晓婧 马玉梅 车敏娜 张海霞 冯若飞 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第6期571-576,共6页
目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上... 目的构建白细胞介素-7(interleukin-7,IL-7)基因慢病毒表达载体,并在CHO-K1细胞中稳定表达,为生产试剂级的IL-7奠定基础。方法参照Gen Bank中公布的人IL-7基因核苷酸序列(J04156.1),人工合成该条基因,亚克隆至表达载体pLV-CMV-EF1-GP上,构建重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7,在HEK293T细胞中进行病毒包装,检测病毒滴度后,收获细胞毒液,感染CHO-K1细胞,经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达IL-7的CHO-K1-r IL-7细胞。荧光显微镜观察感染细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR法检测IL-7基因m RNA的转录;ELISA法检测IL-7的含量;Western blot法检测IL-7的表达。结果重组慢病毒表达质粒pLV-CMV-EF1-GP-r IL-7经双酶切及测序结果证明构建正确。慢病毒的滴度为3×10~8 TU/ml。慢病毒感染CHO-K1细胞24、48和72 h后,均可见特异性绿色荧光蛋白表达,且随着培养时间的延长,荧光强度明显增强;CHO-K1-r IL-7细胞可扩增出约540 bp的IL-7基因片段;经ELISA检测,样品中IL-7含量为0.6 ng/ml;表达产物主要存在于CHO-K1-r IL-7细胞上清中,且具有良好的反应原性。结论成功构建了IL-7基因慢病毒重组表达质粒,并实现了IL-7在CHO-K1细胞上的稳定表达。 展开更多
关键词 白细胞介素-7 慢病毒 CHO-K1细胞 稳定表达
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脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究 被引量:1
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作者 张海霞 令瑛 +8 位作者 杨术伟 凡静静 李琼毅 李向茸 马玉梅 包晓婧 魏嘉 马忠仁 冯若飞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期315-321,共7页
为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病... 为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病毒载体,将此载体于H EK 293细胞中包装最终成功获得r Ad-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒r Ad-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/m L;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒 结构蛋白VP1 腺病毒 免疫效果
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膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响 被引量:1
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作者 李琼毅 包晓婧 +6 位作者 张海霞 马玉梅 李向茸 令瑛 魏嘉 马忠仁 冯若飞 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期331-337,共7页
膜联蛋白A2是一种参与调节多种病毒增殖的重要宿主蛋白。本研究通过构建过表达膜联蛋白A2的BHKAnxa2细胞系及瞬时敲低膜联蛋白A2,探讨膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响。通过RT-PCR从BHK-21细胞中扩增膜联蛋白A2全长cD... 膜联蛋白A2是一种参与调节多种病毒增殖的重要宿主蛋白。本研究通过构建过表达膜联蛋白A2的BHKAnxa2细胞系及瞬时敲低膜联蛋白A2,探讨膜联蛋白A2对脑心肌炎病毒在BHK-21细胞中增殖的影响。通过RT-PCR从BHK-21细胞中扩增膜联蛋白A2全长cDNA,测序正确后克隆入pcDNA3.1整合表达载体中;用重组载体pcDNA3.1-Anxa2转染BHK-21细胞,经G418筛选获得抗性克隆,qRT-PCR和Western blot试验证明BHKAnxa2过表达膜联蛋白A2;EMCV感染试验证明BHK-Anxa2细胞中病毒滴度高于对照组。通过siRNA降低BHK-21细胞中膜联蛋白A2表达,EMCV感染试验证明膜联蛋白A2表达下降后EMCV增殖也随之下降。以上试验结果表明鼠膜联蛋白A2表达改变可导致病毒在BHK-21细胞中的增殖发生变化,提示膜联蛋白A2与EMCV在BHK-21细胞中的增殖相关。 展开更多
关键词 脑心肌炎病毒(ECMV) 膜联蛋白A2 BHK-21细胞 SIRNA
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CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价 被引量:3
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作者 包晓婧 张海霞 +7 位作者 李琼毅 马玉梅 令瑛 魏嘉 李向茸 徐雷 冯若飞 马忠仁 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期1141-1146,共6页
为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法... 为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。 展开更多
关键词 实时荧光定量PCR TAQMAN探针 CD63
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