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奶牛乳源外泌体提取方法的优化及效果评价 被引量：1
1
作者 赵莹 王靖雷 +6 位作者 王萌 王立斌 张倩 李志杰 马鑫 余四九 潘阳阳 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期1265-1276,共12页
乳源外泌体在疾病治疗及载体效应等领域应用颇为广泛,但目前乳源外泌体的提取方法仍步骤繁琐,耗时长,难以推广应用。为建立省时、高效和稳定的乳源外泌体提取方法,本试验在前期已建立的差速超速离心法、凝乳酶法、乙酸法及蔗糖密度梯度... 乳源外泌体在疾病治疗及载体效应等领域应用颇为广泛,但目前乳源外泌体的提取方法仍步骤繁琐,耗时长,难以推广应用。为建立省时、高效和稳定的乳源外泌体提取方法,本试验在前期已建立的差速超速离心法、凝乳酶法、乙酸法及蔗糖密度梯度离心法的基础上,通过增加离心速度、改变乙酸或凝乳酶用量、调整蔗糖密度梯度、减少离心步骤进行逐一优化。通过透射电子显微镜、纳米粒子跟踪分析、蛋白浓度检测、免疫印迹鉴定比较乳源外泌体形态结构、粒径大小、蛋白浓度、粒子浓度、特异性标记蛋白的差异,筛选出最优提取方法。结果显示:4种优化后提取方法均可分离获得具有典型“茶托”形状,介于30~200 nm的细胞外囊泡,但优化后的乙酸法提取乳源外泌体最多,视野密度高达80%以上,粒径大小为(151.0±47.2)nm,粒子浓度为6.2×10^(12)个/mL,均高于其他优化方法;优化后的乙酸法提取乳源外泌体的特异性标记蛋白[肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克蛋白70(HSP70)、CD81和CD9]均表达量较高,其他3种优化方法提取到的乳源外泌体特异性标记蛋白发生不同程度降解,且提取乳源外泌体所得样品蛋白浓度均显著高于优化的乙酸法(P<0.05)。结果表明,优化后奶牛乳源外泌体乙酸提取法具有方法简单、耗时短、纯度高、特异性标记蛋白稳定等优点,该方法为外泌体需求量大的试验、医疗、工业生产等奠定一定基础。 展开更多
关键词 乳源外泌体 差速超速离心法 乙酸 凝乳酶 提取鉴定
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牦牛HMGN1多克隆抗体制备及应用
2
作者 李玉平 王立斌 +5 位作者 潘阳阳 王萌 张晖 张瑞 贾利毅 余四九 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期2106-2115,共10页
为了克隆牦牛高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1)基因并制备牦牛HMGN1多克隆抗体,探究HMGN1在牦牛生殖生理研究过程中的作用,本研究通过基因克隆获得牦牛HMGN1基因序列并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HMGN1... 为了克隆牦牛高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1)基因并制备牦牛HMGN1多克隆抗体,探究HMGN1在牦牛生殖生理研究过程中的作用,本研究通过基因克隆获得牦牛HMGN1基因序列并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测HMGN1在牦牛子宫、卵巢、输卵管中的相对表达量。利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛HMGN1重组蛋白,免疫10月龄新西兰大白兔,亲和层析法纯化所制备的牦牛HMGN1多克隆抗体;分别利用蛋白免疫印迹(WB)、免疫组织化学技术(IHC)检测HMGN1在牦牛生殖器官中的表达和定位;利用免疫荧光技术(IF)检测HMGN1蛋白在颗粒细胞中的表达。本试验成功克隆了牦牛HMGN1基因并制备了牦牛HMGN1多克隆抗体。WB结果显示,HMGN1蛋白在黄体期和卵泡期牦牛子宫的表达量高,妊娠期的表达量最低(P<0.05);卵巢组织中,妊娠期的表达量最高,卵泡期的表达量最低(P<0.05);输卵管中妊娠期的表达量最高,黄体期和卵泡期的表达量较低(P<0.05)。IHC结果显示,HMGN1主要分布在子宫内膜和子宫腺、卵泡膜和卵泡颗粒层、输卵管黏膜上皮等部位。IF结果显示,HMGN1主要表达在卵巢颗粒细胞的细胞质中。综上,HMGN1在牦牛发情周期和妊娠过程中均参与调节。本研究结果为进一步研究HMGN1蛋白在调节牦牛生殖生理机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 牦牛 HMGN1 原核表达 多克隆抗体
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基于TMT技术的牦牛妊娠期血清蛋白质组学分析
3
作者 姚颖 周应聪 +7 位作者 杜培岩 李一娟 钱文洁 李柳杨 余志鹏 崔燕 余四九 樊江峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期192-206,共15页
为了探究妊娠期内牦牛血清的蛋白质组特征,筛选并分析差异表达蛋白质(DEPs)在牦牛妊娠维持中的作用。本研究选择9头4岁半至6岁龄健康状况良好且当年未产犊的自然发情母牦牛进行人工授精(AI)。在AI后第30、60及90天采集其血清样品,并对... 为了探究妊娠期内牦牛血清的蛋白质组特征,筛选并分析差异表达蛋白质(DEPs)在牦牛妊娠维持中的作用。本研究选择9头4岁半至6岁龄健康状况良好且当年未产犊的自然发情母牦牛进行人工授精(AI)。在AI后第30、60及90天采集其血清样品,并对授配母牦牛进行妊娠诊断。依据诊断结果将采集的样品进行回顾性分组,即妊娠第1、2、3月组及未妊娠组(未妊娠组样品来自AI后90天经妊娠诊断确诊为未孕的牦牛个体),每组样品3个生物学重复。利用串联质谱标签(TMT)技术对牦牛血清样品的蛋白表达情况进行定量分析,筛选差异表达蛋白,并对其进行GO功能富集和KEGG通路等生物信息学分析,进一步筛选与牦牛妊娠维持相关的潜在蛋白。结果显示,在4组牦牛血清蛋白样品中共获得497个蛋白,以差异倍数≥1.2或≤0.83,且P<0.05为条件筛选,共筛选到68个差异蛋白。GO功能富集和KEGG通路分析显示,这些DEPs在代谢、免疫系统、粘附、生物调节等生物学过程以及补体与凝血级联、金黄色葡萄球菌感染等与炎症和免疫途径相关的通路有明显富集。值得注意的是,妊娠期各组间差异蛋白富集通路中均包含有PI3K-Akt、Rap1、MAPK等与生殖相关的信号通路。DEPs中IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1的表达具有随妊娠时间的延长而连续上调的趋势,且这些蛋白在妊娠第3月表达量显著高于未妊娠状态。研究结果表明,牦牛妊娠早期存在明显的血清蛋白组的变化。这些DEPs分别在促进细胞粘附与增殖、母胎血管生成、维持母体代谢与免疫平衡等过程中起到重要作用。尤其是IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1可能通过参与调节胎盘生长发育、免疫应答和脂质代谢等过程,在牦牛妊娠维持中发挥着重要作用。研究结果为进一步探明牦牛维持妊娠过程的调控机制提供了基础资料。 展开更多
关键词 TMT 蛋白质组学 牦牛 血清 差异表达蛋白 妊娠维持
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辐照技术在疫苗研发中的应用
4
作者 周婷 孙梦坤 +1 位作者 余四九 崔燕 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3383-3394,共12页
病原体灭活是生产灭活疫苗最关键和最基本的技术。理想的灭活方式是彻底灭活病原体并保持抗原的免疫原性,且无化学残留。与传统灭活方式相比,辐照技术在疫苗研发中的主要优势是它能够穿透病原体,但对病原体表面抗原蛋白造成的损伤较小,... 病原体灭活是生产灭活疫苗最关键和最基本的技术。理想的灭活方式是彻底灭活病原体并保持抗原的免疫原性,且无化学残留。与传统灭活方式相比,辐照技术在疫苗研发中的主要优势是它能够穿透病原体,但对病原体表面抗原蛋白造成的损伤较小,且灭活后不需要去除任何化学残留物,因此更适合用于研发安全有效的灭活疫苗。本文简要回顾和总结了辐照技术应用于疫苗研发的历史和进展,讨论了辐照技术在疫苗研发中的应用的潜在策略。 展开更多
关键词 辐照技术 电子束 Γ射线 X射线 疫苗
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促红细胞生成素对牦牛肾间质成纤维细胞凋亡因子表达的影响
5
作者 卢增华 崔燕 +6 位作者 余四九 白雪峰 卢鸿琴 何俊峰 卢凯 翟国亮 祁正满 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3460-3471,共12页
旨在探讨促红细胞生成素(EPO)对牦牛肾间质成纤维细胞(RIFs)中凋亡因子的影响。本研究首先分别采集3头4岁龄的健康牦牛和黄牛的肾脏组织,采用免疫组织化学方法和Western blot检测牦牛和黄牛肾脏中EPO的准确分布及其表达量。同时对牦牛R... 旨在探讨促红细胞生成素(EPO)对牦牛肾间质成纤维细胞(RIFs)中凋亡因子的影响。本研究首先分别采集3头4岁龄的健康牦牛和黄牛的肾脏组织,采用免疫组织化学方法和Western blot检测牦牛和黄牛肾脏中EPO的准确分布及其表达量。同时对牦牛RIFs进行原代培养鉴定,并对其进行不同药物处理来调控RIFs中EPO表达水平,检测EPO对凋亡相关基因Bax,Bcl-2,PCNA在mRNA和蛋白表达水平的影响。免疫组化学检测结果显示,EPO在牦牛和黄牛肾脏中集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞和小管周间质成纤维样细胞中均呈阳性表达。qRT-PCR和Western blot结果显示,EPO在牦牛肾脏中的表达量显著高于黄牛(P<0.001)。随后对生成EPO的RIFs进行原代培养并调控EPO的表达,结果表明:激活组显著升高RIFs中Bcl-2和PCNA的表达,降低Bax的表达(P<0.001)。EPO抑制组显著降低RIFs中Bcl-2、PCNA的表达,上调Bax的表达(P<0.001)。综上表明,EPO在牦牛和黄牛肾脏中集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞和小管周间质成纤维样细胞中均呈阳性表达,牦牛肾脏中的EPO高表达能够促进RIFs中Bcl-2和PCNA的表达,并降低Bax的表达,说明EPO可以在牦牛肾脏中起到抗凋亡的作用。 展开更多
关键词 牦牛 促红细胞生成素(EPO) 肾间质成纤维细胞(RIFs) 凋亡
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初生及成年牦牛大脑皮质的转录组分析 被引量：1
6
作者 张倩 崔燕 +3 位作者 余四九 何俊峰 潘阳阳 王萌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4605-4614,共10页
旨在分析初生和成年牦牛大脑皮质转录组表达谱,筛选影响大脑皮质发育的候选基因。本研究选取初生(1~7日龄(NYB),n=3)和成年(3~4岁(AYB),n=3)牦牛,放血处死,采集大脑皮质,利用Illumina HiSeq平台对转录组进行测序与分析,筛选得到差异表... 旨在分析初生和成年牦牛大脑皮质转录组表达谱,筛选影响大脑皮质发育的候选基因。本研究选取初生(1~7日龄(NYB),n=3)和成年(3~4岁(AYB),n=3)牦牛,放血处死,采集大脑皮质,利用Illumina HiSeq平台对转录组进行测序与分析,筛选得到差异表达基因,在此基础上对差异基因进行GO功能注释、KEGG富集分析和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法验证。测序结果共分析得到了4790个显著差异表达的基因(P<0.05),其中包括2670个上调表达的差异基因,2120个下调表达的差异基因。随机选取了9个差异基因进行qRT-PCR验证,表达趋势与转录组测序结果一致,表明测序结果可靠。GO功能注释发现其中占比较多的条目为与蛋白合成及ATP利用相关的转录调控、RNA聚合酶II正调控转录、蛋白结合及ATP结合;KEGG富集分析发现占比较多与大脑发育相关的通路为调控轴突发育及重塑的轴突导向通路,与神经胶质细胞增殖相关的MAPK信号通路,与突触传递相关的神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt、钙信号及磷脂酶D信号通路,与免疫防御相关的Toll样受体通路,与低氧适应调控相关的HIF信号通路。从富集通路中发现,Slit2、SEMA 5A、BDNF、Rab 3a、FGF18、HIF 1α、HIF 2α、NGF、VEGF A、CaMK 2A、PLD1、TLR1、TLR 4基因可能是影响牦牛大脑皮质发育的候选基因。上述结果提示,成年牦牛大脑皮质的突触发育、可塑性和传递、免疫防御可能更活跃,并且低氧适应性更强,这为进一步探讨牦牛大脑发育潜在分子机理提供了一定参考。 展开更多
关键词 牦牛 大脑皮质 初生 成年 转录组
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抑制素A对牦牛颗粒细胞FSH、LH及其受体表达的影响 被引量：1
7
作者 王立斌 王军乾 +5 位作者 赵凌 黄振华 王萌 王靖雷 余四九 潘阳阳 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期51-59,共9页
为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外... 为了探明抑制素A(INHA)对牦牛卵泡颗粒细胞中促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)与其受体结合发挥的作用,通过体外培养牦牛卵泡颗粒细胞,采用免疫荧光技术(IF)检测促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在颗粒细胞中的分布情况,用不同浓度外源性INHA(0、1.25、2.5、5、10、20 ng·mL^(-1))作用12 h后,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测颗粒细胞中FSHβ、LHβ、FSHR、LHR基因的表达情况,采用酶联免疫分析试验(ELISA)检测细胞内外FSH、LH的含量。结果显示,FSHR和LHR在颗粒细胞质与细胞核中均有表达。FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达随INHA浓度的增大呈先降后升的趋势;INHA浓度接近5 ng·mL^(-1)时,FSHβ表达最低;INHA浓度接近10 ng·mL^(-1)时,LHβ表达最低;FSHR和LHR基因的表达与INHA浓度呈负相关。INHA浓度接近5 ng·mL^(-1)时,颗粒细胞内外FSH含量最低;INHA浓度接近10 ng·mL^(-1)时,颗粒细胞内外LH含量最低;其他INHA浓度下,当颗粒细胞内容物中FSH和LH含量降低时,细胞上清中含量升高。综上所述,INHA对FSHR和LHR基因在颗粒细胞中的表达存在明显的抑制作用,并且影响FSHβ和LHβ基因在颗粒细胞中的表达。研究表明INHA可以抑制牦牛卵泡颗粒细胞中FSH、LH与其受体的结合;同时,INHA对颗粒细胞内外FSH和LH的含量具有重要调节作用。本研究为进一步探索抑制素对雌性牦牛生殖调控的影响提供了理论依据。 展开更多
关键词 颗粒细胞 抑制素A(INHA) 促卵泡素(FSH) 促黄体素(LH) 受体
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甘南牦牛三种血液原虫多重PCR检测方法建立及流行病学调查 被引量：1
8
作者 陈亚明 李勇生 +4 位作者 高生智 张莉 徐庚全 潘阳阳 余四九 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期699-706,共8页
为建立一种能同时快速检测弓形虫、环形泰勒虫、新孢子虫3种甘南牦牛血液原虫的多重PCR检测方法,掌握3种血液原虫在甘南牦牛中的流行情况,本研究以弓形虫hypothetical protein基因、环形泰勒虫Tams1基因、新孢子虫Nc-p43基因为靶标设计... 为建立一种能同时快速检测弓形虫、环形泰勒虫、新孢子虫3种甘南牦牛血液原虫的多重PCR检测方法,掌握3种血液原虫在甘南牦牛中的流行情况,本研究以弓形虫hypothetical protein基因、环形泰勒虫Tams1基因、新孢子虫Nc-p43基因为靶标设计3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立检测3种血液原虫的多重PCR方法,并检测甘南地区629份牦牛血清样品,进行流行病学分析。结果显示,建立的牦牛3种血液原虫多重PCR检测方法,具有特异性强、敏感性高和重复性好的优点,检测弓形虫、环形泰勒虫和新孢子虫DNA的最低浓度分别为0.01、0.02、0.01 ng·μL^(-1);流行病学调查结果显示,弓形虫、环形泰勒虫和新孢子虫的阳性率分别为4.29%、3.66%、5.88%,并存在混合感染现象,整体混合感染率为13.68%;季节性流行病学分析显示,3种原虫单一感染率均为冬季最高、春季最低(P>0.05),整体感染率为冬季最高、夏季最低(P>0.05)。按不同年龄分析,0~3岁牦牛3种原虫的整体感染率为27.83%,大于3岁的整体感染率27.46%(P>0.05)。分析风险因素发现,季节和年龄均不是牦牛感染3种原虫的风险因素(P>0.05)。本研究成功建立的多重PCR检测方法,可用于牦牛弓形虫、环形泰勒虫和新孢子虫的鉴别检测和流行病学调查,并检测了甘南地区牦牛三种血液原虫的流行情况,为该病的预防提供了重要的数据支撑。 展开更多
关键词 牦牛 原虫 多重PCR 流行病学调查
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牦牛早期胚胎核旁斑点形成及对后续发育的影响
9
作者 潘阳阳 王靖雷 +8 位作者 王萌 王立斌 张倩 陈睿 张甜甜 崔燕 徐庚全 樊江峰 余四九 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1189-1203,共15页
【目的】明确牦牛早期胚胎发育过程中核旁斑点形成的关键时期,确定其参与形成长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs),探索核旁斑点形成对后续胚胎发育能力的影响及调控机制。【方法】体外受精生产牦牛胚胎,DAPI染色标记结合核旁... 【目的】明确牦牛早期胚胎发育过程中核旁斑点形成的关键时期,确定其参与形成长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs),探索核旁斑点形成对后续胚胎发育能力的影响及调控机制。【方法】体外受精生产牦牛胚胎,DAPI染色标记结合核旁斑点结构蛋白1(paraspeckle Protein 1,PSPC1)mRNA实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测确定牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成关键时期,免疫荧光技术验证胚胎PSPC1蛋白表达水平;qRT-PCR检测核旁斑点形成相关LncRNAs核旁斑点组装转录因子1(encoding nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1)、共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(coactivator associated arginine methyltransferase 1,CARM1)及54 kD核结合蛋白(non-POU domain containing octamer-binding protein,p54nrb)mRNA在各时期胚胎中表达水平;RNA干扰技术抑制合子PSPC1 mRNA水平,比较后续各阶段胚胎发育率,通过分析囊胚细胞总数、滋养层细胞数(trophoblast cells,TE)、内细胞团数(inner cell mass,ICM)评估囊胚质量;检测对照组和PSPC1 mRNA干扰组囊胚中B-细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因(B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(B-cell lymphoma/leukemia associatedx protein,Bax)表达水平。【结果】(1)在不同发育阶段胚胎细胞的细胞核均可观察到核旁斑点,但2-细胞和4-细胞时期胚胎细胞核中核旁斑点更为清晰,2-细胞至桑椹胚阶段PSPC1 mRNA呈现高水平表达,其中4-细胞到桑椹胚阶段PSPC1 mRNA水平最高,PSPC1蛋白荧光强度在此阶段最强。(2)NEAT1、CARM1及p54nrb mRNA均在2-细胞到桑椹胚阶段呈现高水平表达,其中NEAT1和p54nrb在4细胞时期水平最高,CARM1在2-细胞到桑椹胚3个阶段表达水平差异不显著(P>0.05)。(3)PSPC1 mRNA干扰组桑椹胚与囊胚发育率均显著降低,且桑椹胚发育率降低幅度高于囊胚,PSPC1 mRNA干扰组囊胚细胞总数显著低于对照组,其中以ICM细胞数降低为主,TE细胞数在两组之间差异不显著。(4)PSPC1 mRNA干扰处理组囊胚中促细胞凋亡因子Bax mRNA和蛋白均显著增加,抑凋亡相关因子Bcl-2 mRNA和蛋白降低,且囊胚中内细胞团发生裂解。【结论】牦牛早期胚胎发育核旁斑点形成的关键时期为2-细胞至桑椹胚阶段,其中主要集中在4-细胞时期,且PSPC1、NEAT1、CRAM1、p54nrb在核旁斑点形成时期呈高水平表达。干扰牦牛合子PSPC1 mRNA导致后续胚胎发育能力降低,并通过诱导ICM凋亡降低囊胚质量,影响囊胚中细胞命运决定。 展开更多
关键词 牦牛 核旁斑点 细胞命运 细胞凋亡 长链非编码RNA(LncRNAs)
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不同父本冻精杂交甘南牦牛母本围产期疾病发生率分析
10
作者 潘阳阳 王立斌 +6 位作者 郭淑珍 马登录 徐庚全 樊江峰 訾云南 拉毛杰布 余四九 《中国牛业科学》 2023年第2期34-38,共5页
[目的]为提高甘南农牧交错区牦牛生产性能筛选最佳杂交父本。[方法]分别选取荷斯坦奶牛、西门塔尔、安格斯、娟姗牛优质冻精杂交甘南牦牛,比较妊娠牦牛的流产率、难产率,产后胎衣不下、子宫内膜炎症的发生率,产后当年与第二年发情的比率... [目的]为提高甘南农牧交错区牦牛生产性能筛选最佳杂交父本。[方法]分别选取荷斯坦奶牛、西门塔尔、安格斯、娟姗牛优质冻精杂交甘南牦牛,比较妊娠牦牛的流产率、难产率,产后胎衣不下、子宫内膜炎症的发生率,产后当年与第二年发情的比率。[结果]荷斯坦奶牛、西门塔尔冻精人工授精甘南牦牛时,母本妊娠期的流产率和难产率显著高于安格斯、娟姗牛(P<0.05),荷斯坦奶牛、西门塔尔、安格斯作为父本杂交,母本的产后胎衣不下、子宫内膜炎症发病率显著高于娟姗牛(P<0.05)。娟姗牛冻精人工授精甘南牦牛,母本产后当年与第二年发情的比率分别为39.22±1.65%和35.29±1.84%,显著高于其他种公牛冻精杂交后母本的发情率,且只有娟姗牛试验组当年发情率高于第二年发情率。[结论]娟姗牛为父本时,围产期疾病发生率最低,繁育潜能利用率最高,可作为改良甘南牦牛最佳父本。 展开更多
关键词 牦牛 杂交利用 人工授精 胎衣不下 子宫内膜炎
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娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术的优化与应用
11
作者 王立斌 余四九 +7 位作者 徐庚全 樊江峰 包永清 郭淑珍 马登录 訾云南 拉毛杰布 潘阳阳 《甘肃畜牧兽医》 2023年第2期102-108,共7页
人工授精技术已成为改良甘南牦牛的关键辅助性繁殖技术手段,研究发现娟姗牛是甘南母牦牛杂交改良的最佳父本,因此建立了一套标准化、易于操作的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛的辅助生殖技术,对当地牦牛种质资源创新利用具有重要意义。... 人工授精技术已成为改良甘南牦牛的关键辅助性繁殖技术手段,研究发现娟姗牛是甘南母牦牛杂交改良的最佳父本,因此建立了一套标准化、易于操作的娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛的辅助生殖技术,对当地牦牛种质资源创新利用具有重要意义。本研究从待配母牦牛个体的筛选、群体的组建、饲养与管理、冻精质量与受精潜能的评估、牦牛发情临床鉴定、人工授精标准程序、妊娠诊断与管理等环节,对娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛的标准进行完善,在夏河县多家牦牛养殖合作社进行推广应用,并通过比较授精技术优化前后母牦牛的产道疾病、受胎率与产犊率,分析牦牛生产效果。结果显示,娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛辅助繁殖技术优化后,牦牛发情鉴定准确率高达85.98%,群体受配后整体妊娠率为85.86%,产犊率为92.09%,与传统授精技术相比显著提高;且授精后牦牛产道疾病发生率及胎衣不下、子宫脱出等围产期疾病发生率显著降低,说明优化后娟姗牛冻精人工授精甘南母牦牛技术可显著提升牦牛杂交改良的生产效果。 展开更多
关键词 牦牛 娟姗牛冻精 人工授精 优化 生产效果
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荷斯坦奶牛乳与牦牛乳的差异蛋白质组学分析 被引量：6
12
作者 邱山桐 王萌 +5 位作者 高娜 余震 徐庚全 余四九 王立斌 潘阳阳 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期335-349,共15页
本试验利用蛋白质组学方法分析荷斯坦奶牛乳与牦牛乳乳清与乳脂肪球膜中的差异蛋白,比较功能差异,为开发不同品种牛乳提供帮助。通过离心法分离荷斯坦奶牛乳与牦牛乳的乳清与乳脂,分别提取蛋白,通过串联质谱标签(TMT)法进行蛋白质定性... 本试验利用蛋白质组学方法分析荷斯坦奶牛乳与牦牛乳乳清与乳脂肪球膜中的差异蛋白,比较功能差异,为开发不同品种牛乳提供帮助。通过离心法分离荷斯坦奶牛乳与牦牛乳的乳清与乳脂,分别提取蛋白,通过串联质谱标签(TMT)法进行蛋白质定性与定量分析,得到差异蛋白;对差异蛋白进行GO功能注释、KEGG代谢通路、蛋白质互作(PPI)等生物信息学分析。结果显示:牦牛乳的乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物和非乳脂固形物含量均显著高于荷斯坦奶牛乳(P<0.05)。在2种牛乳乳清中共鉴定到可信蛋白641种,在乳脂肪球膜中共鉴定到可信蛋白543种;在乳清中筛选出差异蛋白268种,其中牦牛乳比荷斯坦奶牛乳上调70种,下调198种;在乳脂肪球膜中筛选出差异蛋白267种,其中牦牛乳比荷斯坦奶牛乳上调68种,下调199种。GO功能注释及富集分析表明2种牛乳的乳清和乳脂肪球膜差异蛋白均主要富集在细胞外空间、小分子结合和免疫反应等方面。KEGG注释及富集分析表明2种牛乳的乳清和乳脂肪球膜差异蛋白主要富集在金黄色葡萄球菌感染、补体与凝血级联等通路。差异蛋白互作网络分析发现2种牛乳的乳清差异蛋白中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α2-HS糖蛋白(AHSG)、簇集蛋白(CLU)、血红素结合蛋白(HP)、补体3(C3)、SERPINA1、热休克蛋白A8(HSPA8)、β-2-微球蛋白(B2M)等度值较高,可能为乳清中的关键蛋白;乳脂肪球膜差异蛋白中血清白蛋白(ALB)、HP、C3、CLU、α-2-巨球蛋白(A2M)、AHSG、HSPA8、B2M等度值较高,可能为乳脂中的关键蛋白。综上可知,牦牛乳较荷斯坦奶牛乳在营养价值方面更优;牦牛乳中丰度较高的蛋白在胃肠道免疫功能、促进钙与磷吸收等方面表现优异,且牦牛乳中部分高丰度蛋白易引起乳制品腐败变质。 展开更多
关键词 荷斯坦奶牛 牦牛 乳清蛋白 乳脂肪球膜蛋白 蛋白质组学
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牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用 被引量：2
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作者 焦正兴 潘阳阳 +7 位作者 王萌 王靖雷 马文斌 高翔 张晖 崔燕 余四九 王立斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2436-2447,共12页
旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达... 旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示,本研究成功克隆了牦牛LC 3B基因(登录号:OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清,抗体效价分别为1∶640000和1∶320000,特异性良好,表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测,LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达,并且能识别LC3B-Ⅰ和发生脂化后的LC3B-Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC 3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体,使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。 展开更多
关键词 牦牛 LC3B 原核表达 多克隆抗体 生殖
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泌乳高峰期娟犏牛和牦牛乳汁差异蛋白分析 被引量：2
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作者 高娜 潘阳阳 +5 位作者 王萌 王立斌 邱山桐 余震 余四九 徐庚全 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1323-1334,共12页
娟犏牛(Bos taurus)是通过娟姗牛冻精杂交甘南牦牛(Bos grunniens)所产的后代,其产奶量高于牦牛。为探究娟犏牛乳品质与牦牛乳差异,对泌乳高峰期娟犏牛与牦牛的乳汁进行了蛋白质组学分析。通过串联质谱(TMT)标记蛋白质组学方法比较两种... 娟犏牛(Bos taurus)是通过娟姗牛冻精杂交甘南牦牛(Bos grunniens)所产的后代,其产奶量高于牦牛。为探究娟犏牛乳品质与牦牛乳差异,对泌乳高峰期娟犏牛与牦牛的乳汁进行了蛋白质组学分析。通过串联质谱(TMT)标记蛋白质组学方法比较两种奶的乳清和乳脂球膜(MFGM)蛋白差异,结果表明,利用标记定量蛋白质组学技术在泌乳高峰期娟犏牛奶与牦牛奶中共鉴定到651个乳清蛋白和990个MFGM蛋白,筛选出乳清差异表达蛋白(DEPs)145个,其中娟犏牛奶比牦牛奶上调71个,下调74个;筛选出MFGM DEPs 160个,其中娟犏牛奶比牦牛奶上调78个,下调82个。生物信息学分析结果发现,泌乳高峰期娟犏牛奶乳清与MFGM DEPs主要参与的生物过程是固有免疫应答,定位的主要细胞成分是胞外间隙和胞外区,而乳清DEPs主要参与的分子功能是蛋白质同源二聚体活性,MFGM DEPs主要参与的分子功能是鸟苷-5'-三磷酸酶(GTPase)活性。娟犏牛奶乳清与MFGM DEPs参与的重要免疫途径是补体与凝血级联。综上可知,娟犏牛奶中丰度较高的主要乳清和MFGM DEPs在促进钙磷吸收、免疫保护和免疫调节等方面表现优异,牦牛奶中丰度较高的主要乳清和MFGM DEPs在保证细胞稳定性、促进T淋巴细胞增殖和抗菌等方面表现优异,说明泌乳高峰期娟犏牛奶较牦牛奶在免疫保护和免疫调节等生物过程中发挥更重要作用,推测娟犏牛奶更有助于新生儿建立抗微生物感染的免疫系统。本研究结果为高原奶制品的开发提供了数据支撑,并为生产功能性婴幼儿配方乳粉提供了科学依据。 展开更多
关键词 娟犏牛奶 牦牛奶 乳清蛋白 乳脂球膜蛋白 蛋白质组学
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娟犏牛与牦牛乳汁相同蛋白质组学分析 被引量：1
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作者 高娜 徐庚全 +5 位作者 王萌 王立斌 邱山桐 余震 余四九 潘阳阳 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2023年第S01期381-392,共12页
利用蛋白质组学的方法对娟犏牛奶与牦牛奶乳清和乳脂球膜(MFGM)相同蛋白进行分析,而娟犏牛产奶量高于牦牛,若娟犏牛奶的功能与牦牛奶相近,将提高当地牧民的经济水平。通过离心法分离乳清与乳脂,分别提取蛋白;通过串联质量标签(TMT)技术... 利用蛋白质组学的方法对娟犏牛奶与牦牛奶乳清和乳脂球膜(MFGM)相同蛋白进行分析,而娟犏牛产奶量高于牦牛,若娟犏牛奶的功能与牦牛奶相近,将提高当地牧民的经济水平。通过离心法分离乳清与乳脂,分别提取蛋白;通过串联质量标签(TMT)技术,进行蛋白质定性与定量分析得到相同蛋白;对相同蛋白进行GO功能注释、KEGG代谢通路、蛋白互作等生物信息学分析。结果表明,利用标记定量蛋白质组学技术在娟犏牛奶与牦牛奶中共鉴定到651种乳清蛋白和990种MFGM蛋白,筛选出298种乳清相同蛋白,283种MFGM相同蛋白。GO注释分析发现,鉴定的娟犏牛奶与牦牛奶乳清相同蛋白主要参与的生物过程是内肽酶活性的负调控、免疫应答和免疫球蛋白产生,MFGM相同蛋白参与的生物过程主要是内肽酶活性的负调控和补体激活,经典途径乳清与MFGM相同蛋白定位的细胞成分主要是胞外间隙和胞外区,参与的分子功能主要是三磷酸鸟苷(GTP)酶活性、GTP结合。KEGG富集分析发现,娟犏牛奶与牦牛奶乳清与MFGM相同蛋白主要富集的途径包括补体和凝血级联反应、吞噬体和内质网中的蛋白加工。娟犏牛奶和牦牛奶中丰度较高的蛋白显示出其在免疫和促进营养吸收等方面表现优异,然而,娟犏牛产奶量高于牦牛,这将增加当地牧民的经济收入,也为人们提供更多有价值的高原奶制品。 展开更多
关键词 娟犏牛奶 牦牛奶 乳清蛋白 乳脂球膜蛋白 蛋白质组学
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地西泮结合抑制剂在牦牛不同大小卵泡中的表达与定位
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作者 王立斌 王强龙 +6 位作者 潘阳阳 黄振华 赵天 丁天翊 刘敏清 崔燕 余四九 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第8期11-17,共7页
【目的】研究地西泮结合抑制剂(diazepam binding inhibitor, DBI)在牦牛不同大小卵泡中的表达水平与定位,探讨DBI蛋白在牦牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采集牦牛卵巢组织,分离不同大小(直径<3 mm,直径3~8 mm,直径>8 mm)... 【目的】研究地西泮结合抑制剂(diazepam binding inhibitor, DBI)在牦牛不同大小卵泡中的表达水平与定位,探讨DBI蛋白在牦牛卵泡发育过程中的调控作用。【方法】采集牦牛卵巢组织,分离不同大小(直径<3 mm,直径3~8 mm,直径>8 mm)的卵泡。采用实时荧光定量方法(qRT-PCR)检测DBI基因mRNA在牦牛不同大小卵泡中的相对表达量,并利用蛋白免疫印迹技术(Western-blotting, WB)检测DBI蛋白的表达情况。采用免疫组织化学方法(immunohisto chemistry, IHC)定位DBI蛋白在雌性牦牛完整成熟卵泡中的分布情况。采用免疫荧光技术(immunofluorescence, IF)检测DBI在牦牛卵母细胞中的定位。【结果】DBI基因mRNA和DBI蛋白在牦牛不同大小卵泡中均表达,但表达水平存在显著差异(P<0.05),表达量随着牦牛卵泡直径的增大而显著上升。DBI蛋白在牦牛成熟卵泡中的颗粒细胞、卵丘细胞均有分布;在卵母细胞中主要定位于细胞质、细胞核。【结论】DBI在类固醇激素合成与卵母细胞成熟过程中具有重要作用。 展开更多
关键词 牦牛 地西泮结合抑制剂 卵泡发育 卵母细胞 表达与定位
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乳源外泌体在乳腺炎防控中的生物学功能研究进展
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作者 赵莹 王萌 +5 位作者 李志杰 马鑫 王立斌 张倩 余四九 潘阳阳 《动物医学进展》 北大核心 2023年第8期76-81,共6页
外泌体是一种广泛存在于动物体液组织中的纳米细胞外囊泡。作为一种载体,包裹蛋白质、脂质、核酸、聚糖等,可介导细胞间的信息转递。乳源性外泌体,作为哺乳动物机体常见外泌体,被机体消化道吸收后可有效促进免疫系统和防御系统功能,其... 外泌体是一种广泛存在于动物体液组织中的纳米细胞外囊泡。作为一种载体,包裹蛋白质、脂质、核酸、聚糖等,可介导细胞间的信息转递。乳源性外泌体,作为哺乳动物机体常见外泌体,被机体消化道吸收后可有效促进免疫系统和防御系统功能,其携带的miRNA和功能蛋白质可改变乳腺上皮细胞基因表达,并参与细胞炎症反应和免疫应答调节。近几年国内外学者将乳源外泌体作为标记分子用于奶牛乳腺炎的诊断,或以其作为药物的载体或靶点,用于奶牛乳腺炎的预防和治疗。论文对有关乳源外泌体在乳腺炎防控中的研究进行了总结,帮助了解乳源外泌体在乳腺炎发生发展中的调节作用,旨在为进一步提升乳源外泌体在奶牛乳腺炎防治中的应用提供参考。 展开更多
关键词 外泌体 乳腺炎 内含物 巨噬细胞 微小RNA
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动物卵泡液外泌体分离方法及主要生殖功能研究进展
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作者 李志杰 赵莹 +4 位作者 马鑫 王萌 余四九 王立斌 潘阳阳 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1480-1488,共9页
外泌体(exosome)是一种广泛存在于各种体液环境和部分组织中的纳米级、均一性膜性囊泡,主要由蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物成分构成。近年来,研究学者已从不同动物的卵泡液中分离出外泌体,并证实卵泡液外泌体参与卵泡... 外泌体(exosome)是一种广泛存在于各种体液环境和部分组织中的纳米级、均一性膜性囊泡,主要由蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物成分构成。近年来,研究学者已从不同动物的卵泡液中分离出外泌体,并证实卵泡液外泌体参与卵泡颗粒细胞的增殖、卵子的形成及发育、动物受精、胚胎发育、以及雄性动物生殖功能等一系列生殖过程,为进一步研究卵泡液外泌体对哺乳动物生殖功能的调控提供新思路。作者重点阐述了卵泡液外泌体分离鉴定的方法、主要成分以及调控哺乳动物生殖功能的分子机制的最新进展,为全面了解外泌体结构功能、生发凋亡和作用机制提供参考,为利用外泌体探索动物生殖理论和提高动物繁殖技术并将其应用于生产实际提供相关基础信息。 展开更多
关键词 外泌体 分离鉴定 卵泡液
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脂联素及其受体在成年牦牛不同部位皮肤中的差异性分析
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作者 徐宏伟 崔燕 +5 位作者 余四九 李仕杰 张慧珠 何俊峰 王继 赵鹏飞 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1362-1369,共8页
为探究脂联素(APN)及其受体(APNR1和APNR2)在成年牦牛不同部位皮肤内的分布和表达情况,以及其在皮肤中可能发挥的作用,选取12头健康成年牦牛,采集毛囊处于生长期的皮肤(颈部、腹部、腋下部和腹股沟部),采用免疫组织化学(IHC)、蛋白免疫... 为探究脂联素(APN)及其受体(APNR1和APNR2)在成年牦牛不同部位皮肤内的分布和表达情况,以及其在皮肤中可能发挥的作用,选取12头健康成年牦牛,采集毛囊处于生长期的皮肤(颈部、腹部、腋下部和腹股沟部),采用免疫组织化学(IHC)、蛋白免疫印迹(WB)和实时荧光定量PCR(qRTPCR)的方法,对APN、APNR1和APNR2的mRNA和蛋白在成年牦牛皮肤中不同部位的表达和分布进行探究。IHC结果表明,APN、APNR1和APNR2在成年牦牛皮肤的表达部位基本相同,其主要分布于皮肤的表皮层、皮脂腺、汗腺、血管及毛囊的上皮根鞘。WB结果表明,APN、APNR1和APNR2蛋白在颈部和腹部(多毛皮肤)的表达量显著高于腋下和腹股沟部(少毛皮肤)(P<0.05),APNR1在颈部和腹部的表达量显著高于APNR2(P<0.05)。qRT-PCR结果表明,APN、APNR1和APNR2的表达在mRNA水平上存在差异。APN和APNR1的mRNA在颈部和腹股沟部的表达量显著高于腹部(P<0.05);APNR2的mRNA水平在颈部表达量显著高于腹股沟部(P<0.05)。首次在成年牦牛皮肤上检测到了APN、APNR1和APNR2的表达,不同部位皮肤组织中的表达位置基本相同,主要分布于皮肤的表皮层、皮脂腺、汗腺、血管及毛囊的上皮根鞘。同时通过对APNR1和APNR2在蛋白水平上的对比,推测APN主要通过APNR1发挥作用。本研究结果为进一步探究APN、APNR1和APNR2对成年牦牛皮肤和毛囊生长发育的影响提供了理论依据。 展开更多
关键词 成年牦牛 皮肤 脂联素(APN) 脂联素受体Ⅰ(APNR1) 脂联素受体Ⅱ(APNR2)
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牦牛卵泡发育过程中MST1和YAP1的表达特征研究
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作者 李一娟 樊江峰 +5 位作者 余四九 张晖 杜培岩 周应聪 钱文洁 姚颖 《中国畜牧杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期126-131,共6页
哺乳动物STE20样激酶1(Mammalian Sterile 20-like Kinase 1,MST1)和Yes相关蛋白1(Yes Associated Protein 1,YAP1)作为Hippo信号通路的主要成员,在哺乳动物胚胎发育、细胞增殖与凋亡、调节器官体积以及维持内环境的稳态等过程中发挥生... 哺乳动物STE20样激酶1(Mammalian Sterile 20-like Kinase 1,MST1)和Yes相关蛋白1(Yes Associated Protein 1,YAP1)作为Hippo信号通路的主要成员,在哺乳动物胚胎发育、细胞增殖与凋亡、调节器官体积以及维持内环境的稳态等过程中发挥生理学效应。为探讨MST1和YAP1对牦牛卵泡发育产生的影响,本实验采集健康牦牛的卵巢,按照卵泡直径大小将其分为小卵泡(2~4 mm)、中卵泡(4~6 mm)、大卵泡(6~8 mm)和超大卵泡(>8 mm),采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western Blotting、免疫组织化学技术,对不同大小卵泡中MST1基因和YAP1基因及其蛋白表达情况进行分析研究。结果显示,MST1和YAP1基因及其蛋白在牦牛各个发育阶段卵泡中均有表达,其表达量在不同大小卵泡中存在一定差异。尤其处于优势化选择阶段时中卵泡的表达量显著高于其他3个期。YAP1在牦牛各发育阶段卵泡中的表达变化与MST1基本一致。从表达部位来看,MST1和YAP1蛋白主要分布于卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞中。结果表明,MST1和YAP1介导的Hippo信号通路参与了牦牛卵泡发育的调控。本研究结果为进一步探明牦牛卵泡发育的分子调控机制、提高牦牛的繁殖效率积累了基础资料。 展开更多
关键词 牦牛 Hippo信号通路 卵泡 生长发育
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