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利用全基因组选择培育高繁猪新品系初步研究 被引量：1
1
作者 付言峰 任守文 +4 位作者 涂枫 王学敏 廖超 俞正玉 程金花 《中国畜牧杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期99-103,109,共6页
为了帮助江苏省某规模种猪场进行高繁大白猪新品系培育,本研究采用猪PorcineSNP50K基因组芯片,对同一猪场186头核心群母猪进行了全基因组SNP分析,再利用一步基因组最佳线性无偏估计法计算出这些猪的基因组估计育种值(GEBV)。实验母猪共... 为了帮助江苏省某规模种猪场进行高繁大白猪新品系培育,本研究采用猪PorcineSNP50K基因组芯片,对同一猪场186头核心群母猪进行了全基因组SNP分析,再利用一步基因组最佳线性无偏估计法计算出这些猪的基因组估计育种值(GEBV)。实验母猪共有8个胎次的960窝产仔记录,其中总产仔数平均12.52头,产活仔数平均10.94头,产仔数高峰在第3~4胎。在实验猪4个繁殖性状和1个生长性状中,达100 kg体重日龄的遗传力最高,且这5个性状间的遗传相关和表型相关都是正相关。核心群和参考群间SNPs基因型主成分有部分聚类到一起。在5个性状中,GEBV平均值中产活仔数最高,GEBV最高值中达100 kg体重日龄最高,GEBV中位数中出生窝重最高,达100 kg体重日龄的最高值和最低值间差异最大。考虑到5个性状间遗传相关和表型相关都是正相关,且达100 kg体重日龄有较高的遗传力,后期可以通过这几个性状的联动正向选育,更高效地获得加系大白猪高繁新品系。 展开更多
关键词 猪 遗传力 遗传相关 全基因组选择 基因组估计育种值
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猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测方法的建立 被引量：4
2
作者 俞正玉 逄凤娇 +9 位作者 孙冰 徐向伟 茅爱华 郭容利 范宝超 杜露平 温立斌 倪艳秀 何孔旺 李彬 《江苏农业科学》 2018年第1期116-118,共3页
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪呕吐、腹泻和脱水,各年龄段的猪均可发病,而哺乳仔猪发病和死亡最为严重。2010年末发生的仔猪腹泻综合征的主要病原为PEDV变异株。根据PEDV变异株S基因发生碱基缺失和... 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)可引起猪呕吐、腹泻和脱水,各年龄段的猪均可发病,而哺乳仔猪发病和死亡最为严重。2010年末发生的仔猪腹泻综合征的主要病原为PEDV变异株。根据PEDV变异株S基因发生碱基缺失和插入的特征设计并合成了1对特异性引物,首次建立了PEDV变异株的RT-PCR检测方法。结果表明,所建立的PCR检测方法特异性强,不和PEDV经典毒株反应,也不与其他动物病原反应;敏感性较高,最低可检测10^(-3)ng/μL,且重复性较好。用该方法对2013—2014年我国华东地区猪场的318份临床样品进行检测,结果发现109份样品(34.3%)为PEDV变异株阳性,表明我国腹泻猪群中PEDV变异株感染较为普遍。本研究建立的PCR方法可以作为PEDV变异株在临床上的一种鉴别诊断技术。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 变异株 RT-PCR 检测 特异性 敏感性 重复性
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鲜奶中肠出血性大肠杆菌O157∶H7的定量PCR检测 被引量：2
3
作者 俞正玉 张碧成 +7 位作者 张强 汪伟 何孔旺 倪艳秀 温立斌 李彬 周萍 张雪寒 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第5期1173-1178,共6页
为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反... 为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反应,分析该方法的敏感性、特异性,并检测鲜奶样品以验证Taqman荧光定量PCR实用性和可靠性。结果表明,建立的定量PCR方法在1μl 1×101拷贝至1μl 1×106拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.996,扩增效率112%。该方法的检测灵敏度为1μl 70拷贝,敏感性较高,而且特异性良好,与其他血清型大肠杆菌、沙门氏杆菌和志贺氏菌等易混淆菌株核酸之间没有交叉反应。批间和批内检测的变异系数(RSD)低于2%,表明该方法重复性良好。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌O157∶H7 荧光定量PCR 鲜奶
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猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及在疫苗评价中的应用(英文) 被引量：2
4
作者 俞正玉 徐向伟 +8 位作者 孙冰 何孔旺 郭容利 杜露平 温立斌 张雪寒 茅爱华 倪艳秀 李彬 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2014年第9期1487-1490,共4页
[目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus．TGEV）的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针，以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品，进行定量PCR反应。[... [目的]建立检测猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus．TGEV）的TaqMan荧光定量PCR方法。[方法]根据TGEV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针，以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品，进行定量PCR反应。[结果]该试验建立的荧光定量PCR方法在10^2～10^10拷贝／μl之间具有良好的线性关系，相关系数达到0．99以上．扩增效率在90％～110％之间。该方法的检测灵敏度为10拷贝，敏感性较高．而且特异性较好，与猪的其他病毒核酸均无交叉反应；批内和批间的变异系数低于3％．表明该方法的重复性较好。应用该方法可以对疫苗的免疫效力进行定量检测和评价．也可以对临床病料进行检测。[结论]该研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好，可为TGEV的流行病学调查、疫苗开发和发病机制等研蜜檬供可靠的工具。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 TaqMan荧光定量PCR 检测
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PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR检测方法的建立及其应用 被引量：18
5
作者 郭容利 何孔旺 +5 位作者 倪艳秀 茅爱华 温立斌 李彬 王小敏 俞正玉 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期1065-1069,共5页
建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、5... 建立了一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(PARV)的三重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544 bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其他病毒无特异性条带。应用该方法对江苏省及周边地区154份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,结果表明:PEDV、TGEV、PARV阳性率分别为53.2%、8.4%、5.2%。PEDV与TGEV混合感染率为5.2%,PEDV与PARV混合感染率为4.5%。该方法的建立对临床上进行这3种疾病混合感染的检测具有重要意义。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪A群猪轮状病毒 多重RT-PCR
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猪博卡病毒NP1基因的克隆与原核表达 被引量：17
6
作者 李彬 毛立 +9 位作者 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 马俊杰 周俊明 吕立新 俞正玉 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期28-31,共4页
猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴... 猪博卡病毒是近年来新发现的一种细小病毒。本研究根据其部分基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了一对引物,采用PCR方法扩增出了猪博卡病毒的NP1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a-NP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为46 kDa的融合蛋白,蛋白表达量较高,而且蛋白以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western Blot结果显示,表达的NP1蛋白能与His抗体发生特异性的免疫反应,表明原核表达的NP1蛋白具有良好的反应原性。 展开更多
关键词 猪博卡病毒 NP1基因 克隆 原核表达
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2008-2010年中国华东地区PRRSV ORF5基因遗传变异分析 被引量：11
7
作者 王小敏 何孔旺 +10 位作者 张文文 陈蔚 茅爱华 俞正玉 温立斌 倪艳秀 张雪寒 吕立新 郭容利 周俊明 李彬 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第18期3886-3894,共9页
【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方... 【目的】对来自2008-2010年中国华东地区7个不同省市的疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪场送检的病料进行PRRSV检测,并对其ORF5基因进行测序,确定当前PRRSV在中国华东地区的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传演化规律。【方法】利用RT-PCR方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的36份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。【结果】260份病料中共检测到118份PRRSV阳性样品,阳性率为45.4%。ORF5序列分析和系统进化树分析结果表明,本试验所获得的36株PRRSV毒株序列均属于北美型,与GenBank中高致病性PRRSV(HP-PRRSV)参考毒株的氨基酸同源性为94.6%-100%,并可分为5个亚群,亚群III与HP-PRRSV同源性最高,几乎所有的亚群中和表位(primary neutralizing epitope,PNE)都存在变异,亚群III和IV相对于其它亚群具有更多的糖基化位点。由于36个毒株是于2008-2010年间采集自安徽、江苏、上海等7省,进化树分析结果表明,病毒的分型并没有呈现明显的地域性。【结论】2008-2010年间中国华东地区普遍存在PRRSV感染,PRRSV流行株为HP-PRRSV,其遗传演化相对稳定,但也具有不同的遗传特征。来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,虽然亚群IV和V只出现在部分省市,但PRRSV的分布没有呈现明显的地域特征。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 华东地区 ORF5基因 遗传变异
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检测CSFV、JEV、PRRSV三种RNA病毒多重RT-PCR方法的建立 被引量：11
8
作者 张雪寒 何孔旺 +2 位作者 郭容利 俞正玉 倪艳秀 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期385-388,共4页
猪瘟病毒(CSFV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提。根据GenBank发表序列选取3对引物建立检测CSFV、JEV和PRRSV病毒的多重RT-PCR方... 猪瘟病毒(CSFV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起严重的种猪繁殖障碍的病原,而且经常混合感染,及时准确诊断是防治的前提。根据GenBank发表序列选取3对引物建立检测CSFV、JEV和PRRSV病毒的多重RT-PCR方法,扩增产物分别为508 bp、380 bp、263 bp。经与IDEXX商品化的检测CSW抗原试剂盒比较,二者的符合率为96.7%;扩增JEV和PRRSV PCR产物分别经EcoR V和Sau3A I酶切得到预期的片段。建立的多重RT-PCR检测JEV、PRRSV和CSFV敏感度分别为12.5个TCID_(50)、10个TCID_(50)和10^(-3)ng总RNA。结果表明该多重RT-PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床三种病毒核酸的检测。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 流行性乙型脑类病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多重RT-PCR
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规模猪场不同日龄仔猪O型口蹄疫母源抗体消长规律及免疫试验 被引量：11
9
作者 吕立新 何孔旺 +2 位作者 倪艳秀 俞正玉 茅爱华 《江苏农业科学》 CSCD 北大核心 2011年第5期304-306,共3页
为确定仔猪口蹄疫疫苗首次免疫时间，以规模化养猪场经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象，利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。结果表明，10、20、30、40日龄仔猪99％以上被保护的分别占... 为确定仔猪口蹄疫疫苗首次免疫时间，以规模化养猪场经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象，利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。结果表明，10、20、30、40日龄仔猪99％以上被保护的分别占该日龄组的60％、80％、80％、50％，50、60、70、80日龄仔猪99％以上被保护的分别占该日龄组的40％、0、0、0，60％以上仔猪未被充分保护。随着日龄的增加，抗体效价明显下降。对检测猪O型口蹄疫抗体小于1：45的45日龄仔猪10头进行猪O型口蹄疫免疫试验，结果O型日蹄疫一免后14d抗体效价≥27的有10份，达到100％保护。因此，对规模化猪场的仔猪进行口蹄疫疫苗的最佳首免时间为45—50日龄。 展开更多
关键词 仔猪 口蹄疫 母源抗体 效价 消长规律
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中国猪群存在Torque teno Virus(TTV)感染 被引量：9
10
作者 温立斌 何孔旺 +11 位作者 杨汉春 郭容利 李成仁 钟书霖 茅爱华 倪艳秀 张雪寒 周俊明 吕立新 俞正玉 李彬 王小敏 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期85-90,共6页
为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，... 为了探讨中国猪群TTV的感染现状以及是否存在新的基因亚型，基于TTV1和TTV2相对保守的5’非翻译区（5’UTR）设计引物，采用PCR法对2008～2009年采集于中国江苏省的138份猪血清进行了检测。结果表明，中国猪群，TTV1的感染率为15．9％，TTV2的为34．8％，共感染率为5．8％。所扩增片断的核苷酸序列分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株之间的核苷酸同源性分别为87．3％～93．8％和74．8％～99．1％，与GenBank其他TTV1和TTV2毒株的同源性分别为69．6％～100．0％和74．8％～99．1％。系统进化分析结果表明，中国TTV1和TTV2流行毒株存在新的基因亚型。 展开更多
关键词 TTV1 TTV2 5’UTR 猪 中国
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出血性大肠杆菌O157：H7 Stx2B-Tir-Stx1B多价融合蛋白表达及免疫原性研究 被引量：9
11
作者 张雪寒 何孔旺 +10 位作者 卢维彩 赵攀登 温立斌 李彬 郭容利 王小敏 倪艳秀 周俊明 俞正玉 茅爱华 吕立新 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2010年第4期180-185,共6页
为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b... 为了更好防治由出血性大肠杆菌O157∶H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗,其中亚单位疫苗时具有很大优势。构建表达tir和stx1b的融合基因,将tir基因中间295个氨基酸残基(Tir295)与stx1b亚基基因72个氨基酸串联构建pGEX-stx2b-tir-stx1b重组质粒,将其转化于BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,该融合蛋白获得了高效表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30%左右。重组蛋白纯化后皮下途径免疫小鼠,能够诱导高滴度(105)的IgG,鼻腔内途径免疫小鼠不仅能够诱导高滴度(104)的IgG,还能诱导高达102的IgA。二免后攻击50LD50的EHECO157∶H7,相对于对照组,免疫组粪便中排菌量明显降低、排菌时间明显缩短。结果表明:该融合蛋白免疫原性良好,并且由Tir、Stx2b和Stx1b三部分抗原组成,可刺激机体产生针对转位紧密素受体(Tir)和志贺毒素(Stx)的抗体,在EHECO157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。 展开更多
关键词 EHECO157∶H7 转位紧密素受体 志贺毒素 融合基因 免疫原性
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Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒 被引量：10
12
作者 张雪寒 何孔旺 +2 位作者 缪文凯 茅爱华 俞正玉 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2008年第4期440-443,共4页
选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqm an探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV。利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80。pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧... 选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqm an探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV。利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80。pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线。以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测。该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数。PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出。用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒。建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病毒 实时定量PCR TAQMAN探针 定量检测
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猪博卡病毒VP2基因的克隆与原核表达 被引量：8
13
作者 李彬 杜露平 +11 位作者 何孔旺 温立斌 茅爱华 张雪寒 倪艳秀 郭容利 王小敏 周俊明 吕立新 俞正玉 胡屹屹 于洋 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第4期796-799,共4页
为研究猪博卡病毒VP2蛋白的功能及其在疫病诊断中的作用,对其基因进行了克隆和原核表达。根据猪博卡病毒基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了1对引物,采用PCR方法扩增猪博卡病毒的VP2基因,并将其克隆到表达载体pET32a(+)... 为研究猪博卡病毒VP2蛋白的功能及其在疫病诊断中的作用,对其基因进行了克隆和原核表达。根据猪博卡病毒基因组序列(GenBank登录号GU902967-GU902971)设计了1对引物,采用PCR方法扩增猪博卡病毒的VP2基因,并将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a-VP2,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为49 000的融合蛋白,蛋白质表达量较高,且以可溶性形式存在于菌体中。表达产物经纯化后,目的蛋白纯度较好。Western blot结果显示,表达的VP2蛋白能与His抗体发生特异性免疫反应。说明该试验成功克隆了猪博卡病毒的VP2基因并进行了原核表达,为研究该蛋白的功能及建立血清学诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 猪博卡病毒 VP2 基因 克隆 原核表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离鉴定及遗传变异分析 被引量：11
14
作者 王小敏 何孔旺 +9 位作者 周忠涛 茅爱华 俞正玉 汪伟 倪艳秀 温立斌 张雪寒 郭容利 李彬 于洋 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期232-238,共7页
从江苏某猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS）发病猪场采集的血清样本中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）毒株,对该毒株的生物学特性进行了鉴定,并对其Nsp2和ORF5序列进行测定和序列比对分析。利用细胞传代的方法对PRRSV检测阳性,PPV... 从江苏某猪繁殖与呼吸综合征（ PRRS）发病猪场采集的血清样本中分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV）毒株,对该毒株的生物学特性进行了鉴定,并对其Nsp2和ORF5序列进行测定和序列比对分析。利用细胞传代的方法对PRRSV检测阳性,PPV和PRV检测阴性的猪血清进行病毒分离。通过RT-PCR、CPE和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并测定其TCID50。测序获得Nsp2和ORF5基因,并利用DNAStar软件进行序列同源性和进化分析。成功分离获得1株PRRSV毒株,该毒株能够在Marc-145细胞上增殖并产生细胞病变,免疫荧光检测可观察到特异性荧光,TCID50为105.5。 Nsp2序列分析表明,该分离株具有HP-PRRSV 30个氨基酸缺失的基因特征,同时495-516位也存在缺失。分离株ORF5基因与其他参考毒株氨基酸同源性为57.1%-99.5%,与NJ-1106的同源性最高,为99.5%。系统进化树分析表明,该分离株属于北美型,与WUH4、NJ-1106等HP-PRRSV毒株属于同一分支。本试验分离得到一株HP-PRRSV变异毒株,为分析我国PRRSV的遗传变异和防控奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 分离与鉴定 遗传变异
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2009～2010年华东地区猪圆环病毒2型的基因型分析 被引量：8
15
作者 王小敏 张文文 +9 位作者 何孔旺 茅爱华 俞正玉 温立斌 倪艳秀 张雪寒 郭容利 吕立新 李彬 周俊明 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第5期1037-1042,共6页
为分析2009～2010年中国华东地区猪圆环病毒2型(PCV2)的基因型分布情况,应用可以区分PCV2a和PCV2b的鉴别PCR,对浙江、江苏、安徽、山东、上海、江西等6省市的210份血液和组织样品进行PCV2检测,并选取10份阳性病料进行全长基因组扩增,应... 为分析2009～2010年中国华东地区猪圆环病毒2型(PCV2)的基因型分布情况,应用可以区分PCV2a和PCV2b的鉴别PCR,对浙江、江苏、安徽、山东、上海、江西等6省市的210份血液和组织样品进行PCV2检测,并选取10份阳性病料进行全长基因组扩增,应用DNAStar软件对获得的10株PCV全长基因和GenBank中的参考毒株进行序列分析和系统进化树分析。结果表明210份病料中107份为PCV2阳性,36份为PCV2a基因型,97份为PCV2b基因型,检出率分别为17.1%和46.2%,两个基因型的共感染率为12.4%。10株分离株的序列分析结果表明,华东地区PCV2流行毒株之间的核苷酸同源性为96.3%～99.9%,与GenBank其他PCV2参考毒株的同源性为95.0%～99.9%。系统进化树分析表明中国华东地区PCV2存在3种基因型:PCV2a、PCV2b和PCV2c。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型(PCV2) 序列分析 基因型 华东地区
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EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用 被引量：7
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作者 李丽 张雪寒 +13 位作者 何孔旺 姜平 赵攀登 叶青 栾晓婷 温立斌 倪艳秀 周俊明 吕立新 郭容利 俞正玉 茅爱华 李彬 王小敏 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期59-66,共8页
建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以E... 建立用于从临床样品中检测EHEC O157:H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157:H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157:H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157:H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157:H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157:H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157:H7和EPEC O55:H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157:H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157:H7:生化试验表明4株EHEC O157:H7具有典型EHECO157:H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157:H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157:H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157:H728#和EHEC O157:H738#致病性强,EHEC O157:H73#和EHEC O157:H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。 展开更多
关键词 O157:H7 二重PCR 方法建立 细菌分离 样品检测
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类猪圆环病毒因子P1核酸链型和极性的研究 被引量：8
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作者 温立斌 何孔旺 +8 位作者 倪艳秀 张雪寒 李彬 王小敏 郭容利 周俊明 俞正玉 茅爱华 吕立新 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期120-122,共3页
研究报道类猪圆环病毒因子P1的核酸链型和极性的研究结果。采用氯化铯平衡密度梯度离心获得较为纯净的病毒粒子后,提取病毒DNA,经S1核酸酶消化、特异性单引物第一轮PCR扩增结合常规第二轮PCR扩增等研究,结果表明,类猪圆环病毒因子P1为... 研究报道类猪圆环病毒因子P1的核酸链型和极性的研究结果。采用氯化铯平衡密度梯度离心获得较为纯净的病毒粒子后,提取病毒DNA,经S1核酸酶消化、特异性单引物第一轮PCR扩增结合常规第二轮PCR扩增等研究,结果表明,类猪圆环病毒因子P1为单股、负链基因组。 展开更多
关键词 类猪圆环病毒因子P1 核酸链型 极性
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猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用 被引量：5
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作者 李彬 刘浩飞 +14 位作者 孙冰 茅爱华 杜露平 何孔旺 郭容利 温立斌 张雪寒 倪艳秀 周俊明 吕立新 俞正玉 王小敏 胡屹屹 祝昊丹 于洋 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期125-129,共5页
为定量检测猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法.根据PEDV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果表明... 为定量检测猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,建立了检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法.根据PEDV基因组中保守的N基因序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有N基因的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应.结果表明,该试验建立的荧光定量PCR方法在1μl 10^1 ～ 10^9拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.99以上,扩增效率在90％与100％之间.该方法的检测灵敏度为10拷贝,与常规RT-PCR方法相比,该方法敏感性更高,而且该检测方法特异性较好,与猪的其他病毒核酸均无交叉反应,批内和批间的变异系数均低于3％,表明该方法的重复性较好.对华东地区采集的130份临床样品进行检测,结果显示,PEDV的阳性率为63.1％. 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 TAQMAN 荧光定量 PCR 流行病学调查
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猪圆环病毒3型PCR检测方法的建立及其应用 被引量：9
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作者 肖琦 茅爱华 +13 位作者 汪伟 俞正玉 郭佳慧 袁万哲 赵攀登 温立斌 范宝超 李彬 朱雪蛟 胡屹屹 郭容利 曲梦 杨倩 何孔旺 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第2期9-14,共6页
根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒... 根据Gen Bank登录的猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)全基因组序列设计并合成了一对特异性引物,经条件优化,建立了检测PCV3的PCR方法,扩增片段大小为932 bp;最低的质粒检测浓度为10 copy/μL;对猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的核酸进行扩增,均无PCV3目的条带出现;随机抽取扩增的16份临床病猪样品目的条带进行TA克隆后测序,结果显示均为PCV3特异性目的片段,16株PCV3江苏毒株扩增序列与已报道的PCV3/US/SD2016和PCV3/CN/Hubei-618基因序列同源性分别为98.4%~99.6%、99.0%~99.8%,而16个毒株之间的同源性为98.3%~100%。利用所建立的PCR方法检测了2014~2017年间收集的江苏省临床病猪样品938份、健康猪样品500份,PCV3的阳性检出率分别为6.93%和0.6%;其中,2014年病猪样品中的阳性率为1.92%,后呈逐渐上升的趋势,2017年达到12.67%。本研究表明,建立的PCR方法特异、敏感,可以用于临床PCV3的检测;PCV3在江苏省猪群2014年已有感染,并呈逐年升高的趋势,应予以重视。 展开更多
关键词 圆环病毒3型 PCR 临床应用
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猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株的分离鉴定及耐药性研究 被引量：9
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作者 王丹丹 陈国强 +7 位作者 张常印 俞正玉 祝昊丹 周俊明 吕立新 何孔旺 李彬 倪艳秀 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第10期3124-3130,共7页
为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原... 为了确定引起2018年5月江苏泰州某规模化养猪场育肥猪发病死亡的病原,本试验无菌采取病死猪肺脏组织,通过病原分离培养、染色观察、生化试验、PCR扩增等方法进行鉴定,随后对分离菌株进行致病性和耐药性试验。结果显示,该分离菌株在病原分离培养过程中,需在含有NAD的培养基中才能生长;该分离菌通过革兰氏染色,显微镜观察细菌呈红色,可判定新分离的菌株为革兰氏阴性菌;根据生化试验和PCR结果可判定该分离菌株为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌;PCR血清型分型结果显示,分离菌株为猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株;小鼠毒力试验结果显示,当分离株菌液浓度达到3×10^8 CFU/mL时便可引起BALB/c小鼠死亡,浓度为2×10^9 CFU/mL时对BALB/c小鼠的致死率达到100%,表明该分离菌株对BALB/c小鼠有较强的致病力及致死性;药敏试验结果表明,该分离菌株对头孢噻吩、头孢噻肟、氨曲南、头孢吡肟、头孢曲松、氧氟沙星等14种抗菌药物高度敏感,对氨苄西林中度敏感,对链霉素耐药。综合以上试验结果表明该猪场存在猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株感染情况。 展开更多
关键词 猪胸膜肺炎放线杆菌血清8型菌株 分离鉴定 药敏试验
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